Матвєєва, Надія АнатоліївнаПотрохов, Андрій Олександрович2024-09-022024-09-022024Потрохов, А. О. Визначення вірусостійкості трансгенних рослин родини Solanaceae, трансформованих гетерологічними генами : дис. … канд. біол. наук : 03.00.20 - біотехнологія / Потрохов Андрій Олександрович. – Київ, 2024. – 181 с.https://ela.kpi.ua/handle/123456789/68625Потрохов А.О. Визначення вірусостійкості трансгенних рослин родини Solanaceae, трансформованих гетерологічними генами. – Кваліфікаційна наукова праця правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 «біотехнологія» – Інститут клітиної біології та генетичної інженерії НАН України, Національний технічний університет України “Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського” МОН України, Київ, 2024. Дисертаційна робота присвячена дослідженню вірусостійких трансгенних рослин родини Solanaceae з різними гетерологічними генами. Мета та завдання дослідження. Вивчення вірусостійкості трансгенних рослин родини Solanaceae з гетерогічними перенесеними генами до РНК вмісних вірусів рослин. Об’єкт дослідження — вірусостійкість трансгенних рослини родини Solanaceae до РНК вірусів рослин. В роботі було досліджено можливість використання генів різного походження для створення вірусостійких трансгенних родини Solanaceae на прикладі рослин Nicotiana tabacum L, Nicotiana bethamiana L, Petunia×hybrida hort. ex E. Vilm. та Solanum tuberosum L. Такий вибір рослин обумовлений тим, що N. tabacum, N. bethamiana вважають ідеальними модельними об’єктами для вірусологічних та генетичних досліджень. Рослини Petunia×hybrida останнім часом набувають великого значення як новий модельний об’єкт досліджень, окрім того вони широко використовуюся в промисловому садівництві. Рослин S. tuberosum виступають в даних дослідженнях, як цінний промисловий вид, який є важливим для економіки України та світу. Автор зазначає, що трансформовані рослини петунії та картоплі були отримані раніше і взяті в дану роботу для вірусологічних досліджень. Автор особисто провів генетичну трансформацію рослини N. tabacum та N. bethamiana з використанням векторних конструкцій з генами inf-2b та ZRNase II. Трансгенні рослини N. bethamiana з геном ZRNase II були використані для створення модельної системи вірус-рослина та оцінки розвитку системної вірусної інфекції. В роботі представлено результати молекулярно-біологічних, біохімічних та вірусологічних досліджень. Інфікування рослин проводили, використовуючи вірус картоплі Y (PVY), вірус тютюнової мозаїки (TMV) та векторну конструкцію з елементами вірусу картоплі Х та флуоресцентного білка GFP. Використання векторної конструкції з елементами вірусу і репортерним білком GFP дозволило візуалізувати розповсюдження вірусу в трансгенних рослинах і оцінити розвиток системної реакції. На початкових етапах роботи методом агробактеріальної трансформації були отримані рослини N. tabacum з геном inf‒2b. Проведена полімеразно-ланцюгова реакція (ПЛР) підтвердила наявність цільового гена. Методом Кербера було показано, що екстракти трансгенних рослин з геном inf–2b виявляли активність інтерферону на культурі клітин перевивних тестикул поросят інфікованих вірусом везикулярного стоматиту. Незважаючи на активність білкового продукту гена inf–2b, після інфікування трансгенних рослин TMV не було виявлено ознак зміни розвитку інфекційного процесу. Трансгенні рослини N. tabacum з геном inf‒2b не характеризувалися зміненою віросостійкістю до фітовірусу. Однак, за рядом біохімічних параметрів, а саме змінами антиоксидантної активності (АОА) та перекисневого окислення ліпідів (ПОЛ) трансгенні рослини характеризувалися тенденцією до підвищення стресостійкості. Електронне мікроскопічне дослідження трансгенних рослин N. tabacum не виявило змін ультраструктури клітин у порівняні з ультраструктурою клітин рослин дикого типу. Генетична трансформація чужорідним геном не призводила до патології в клітинах рослин. Патологічні зміни в клітинах трансгенних рослин, які були інфіковані TMV не відрізнялися від змін в уражених клітинах рослинах дикого типу. Таким чином, було показано що, трансформація рослин тютюну геном inf–2b не призводила до змін вірусостійкості рослин, навіть незважаючи на противірусну активність екстрактів на культурі клітин тварин. В подальшому було досліджено можливість застосування інших генів, а саме генів рибонуклеаз, для створення віростійких рослин. Рослини S. tuberosum та Petunia×hybrida були взяті з колекції трансгенних рослин Інституту клітинної біології та генетичної інженерії. Методом ПЛР було підтверджено, що, незважаючи на тривале зберігання в колекції, досліджувані рослин зберігали цільові гени. В результаті були відібрані сорти картоплі Ласунак та Лугівська, лінії яких містили гени bov (ген отриманий з Bos taurus) та ZRNase II (ген отриманий з рослин Zinnia elegans), а також відібрані лінії гібридних сортів петунії М1 та Р5 з геном ZRNase II. ПЛР підтвердив наявність гена ZRNase II в трансформованих рослин N. benthamiana, які були отримані в процесі роботи. Подальші дослідження проводили з рослинами, які вирощувалися в грунті. Перед початком експериментів усі дослідні рослини були акліматизовані до умов ex vitro. В досліджуваних рослинах визначали загальну РНКазну активність. Було досліджено загальну РНКазну активність в трансгенних лініях сортів картоплі Лугівська та Ласунак та у рослинах дикого типу толерантного сорту Слов’янка. Аналіз показав, що серед вихідних рослин дикого типу найбільа активність виявлена в толерантному сорті Слов’янка. Виявлено, що в трансгенних рослинах загальна РНКазна активність була вищою порівняно з такою активністю у рослин дикого типу. В рослинах сорту Лугівська, що містять ген ZRNase II, активність була найвища серед усіх трансгенних рослин картоплі. Аналіз загальної РНКазної активності у рослинах Petunia hybrida виявив, що активність РНКазна була визою у трансгенних рослинах. Загальна активність РНКаз у різних трансгенних ліній сорту Р5 перевищувала в 1,83-2,10 рази активність в рослинах дикого типу. У трансгенних рослин М1 активність була в 1,34-1,85 рази вищою, ніж у рослин дикого типу. Було встановлено, що у рослинах N. benthamiana загальна активність РНКази у трансгенних рослин була у 4-6 разів вищаб ніж у рослин дикого типу. Для проведення аналізу чутливості рослин до вірусів проводили їх інфікування. Інфікування трансгенних рослини, проводили методом інокуляції вірусовмісного препарату PVY (картопля), або TMV (петунія) шляхом механічного втирання в поверхню листкової пластинки. В якості контролю використовували рослини дикого типу. Після появи виражених симптомів інфекції проводили їх візуальний аналіз. В контрольних рослинах S. tuberosum симптоми інфекції PVY включали: скручування нижніх листків, жовті плями на листках, некроз стебел і жилок, концентричні некрози, затримку росту. Серед вихідних рослин найменш виражені симптоми були в рослинах толерантного сорту Слов’янка. В трансгенних рослинах симптоматична картина була менш вираженою та була пролонгована. Трансгенні рослини S. tuberosum з геном ZRNase II продемонстрували відстрочені або менш помітні симптоми вірусної інфекції у порівнянні з трансгенними рослинами з геном bov. Рослини Petunia hybrida дикого типу, інфіковані TMV, вже на третій тиждень почали проявляти симптоми ураження: мозаїка на листі, крапчастість, деформація листкових пластинок. Причому симптоми були більш яскраво виражені у рослин сорту М1. Симптоматична картина інфекції для сорту Р5 виражалася лише у легкій зморшкуватості листя. В трансгенних рослинах М1 та Р5 симптоми почали з’являтися лише на 4-5 тиждень. Оскільки візуальна діагностика не може вважатися надійним ефективним методом детекції вірусів, для достовірного підтвердження ураження рослин було проведено імуноферментний аналіз (ІФА). Визначення антигенів PVY проводили в модифікації «сендвіч» ІФА. Результати аналізу виявили різні рівні накопичення вірусного антигена. Найбільш чутливим був сорт Ласунак, а найбільш толерантним – Слов’янка. В дослідних лініях трансгенних рослин з геном bov достовірної різниці у рівні вірусних антигенів порівняні з рослинами дикого типу виявлено не було. У трансгенних рослин сорту Лугівська з геном ZRNase II рівень накопичення вірусу був найнижчий серед усіх досліджуваних рослин. Накопичення вірусного антигена TMV в рослинах петунії аналізували методом непрямого ІФА. У трансгенних лініях сорту M1 кількість вірусного антигена була у 3,3 – 4,0 менша ніж у вихідних рослин дикого типу. В рослинах сорту P5 кількість антигена була у 1,62 рази менше порівняно з контролем. Як і рослини N. tabacum, рослини петунії за біохімічними показниками ПОЛ та АОА проявляли тенденцію до розвитку стресостійкості до вірусної інфекціїБ викликаної TMV. В інфікованих рослинах дикого типу, фітовірусна інфекція спричинювала стимулювання ПОЛ та активацію метаболічних процесів та розвиток стрес-реакцій. В 7 трансгенних рослинах спостерігали активізацію процесів АОА та розвиток захисних реакцій. Оскільки рослини Petunia×hybrida не дають чітко вираженої системної реакції TMV для дослідження впливу гена ZRNase II на системне поширення вірусів в трансгенних рослинах була розроблена тест система вірус-рослина з використанням модельних рослин N. bethamiana з геном ZRNase II. В трансгенні рослини N. benthamiana з геном ZRNase II була інфільтрована векторна конструкція, що містила в своєму складі елементи вірусу картоплі Х та репортерний ген gfp. Продукт гена gfp можна візуально ідентифікувати в ультрафіолетовому спектрі, що дозволяє оцінити розповсюдження вірусу по рослині у реальному часі. В результаті дослідження було встановлено, що світіння GFP спочатку з’являлося в сайті первинної інфільтрації. Системне поширення вірусних частинок в рослинах дикого типу спостерігали на другий тиждень після інфільтрації. GFP детектували в молодих листках, судинних пучках, зокрема в районі центральних та бічних жилокок. В трансгенних лініях рослин розвиток системної вірусної реакції був сповільнений. В цих рослинах було відміченою появу нових сигналів в місцях, відмінних від первинної зони інфільтрації, через 2-3 тижнів після візуалізації активної флуоресценції в рослинах дикого типу. Аналіз співвідношення антоціанів до хлорофілів в системі вірусрослина показав, що в трансгенних рослинах цей показник був в 2 рази нижчим порівняно з рослинами дикого типу. Це може бути свідченням більш ефективної роботи антиоксидантної систем в трансгенних лініях тютюну. Таким чином, в результаті проведеної роботи було встановлено, що на відміну від використання гена inf 2b, гени екстраклітиних рибонуклеаз дозволяють отримувати рослини з модифікованою стійкістю до вірусів. У таких трансгенних рослин пригнічуєтеся розвиток вірусної інфекції, хоча і не спостерігається повна його елімінація. З представлених в даному дослідженні підходів оптимальним є використанням генів рибонулеаз рослинного походження.181 с.ukтрансгенні рослиниSolanaceaeстійкість до вірусівсистемна вірусна реакціягетерологічні гениtransgenic plantsresistance to virusessystemic viral responseThesis Doctoral60.604