Біотехнологічні основи лактатдегідрогеназної системи для тестування гліопротекторів астроцитів зорового нерву

Скорочена інформація про документ
dc.contributor.authorНаумчук, Юлія Анатоліївна
dc.date.accessioned2018-09-21T11:57:54Z
dc.date.available2018-09-21T11:57:54Z
dc.date.issued2018
dc.description.abstractenThis thesis presents the results of the development and optimization of a standardized plate reader-based screening platform for glioprotective compounds in optic nerve head astrocytes. Optic nerve head astrocytes (ONHAs) are the major glia cell type in the nonmyelinated optic nerve head where they contribute to extracellular matrix synthesis. Pathological changes in glaucoma include reactive astrocytosis, a process characterized by altered astrocyte gene and protein expression and extracellular matrix remodeling. ONHAs are highly sensitive to mechanical and oxidative stresses and crucial for the maintenance of retinal ganglion cell physiology and function. Therefore, glioprotective strategies with the goal to preserve and/or restore the structural and functional viability of ONHAs to slow progression of glaucoma are of high clinical relevance. Available methods for the evaluation of drug candidates with glioprotective potential in ONHAs are poorly developed, laborious and costly, thus causing a challenge for the development of the novel glioprotective strategies. Therefore, the objective of this work was to establish the scientific premise for glioprotection in primary ONHA culture and to develop a biotechnological method for the screening of glioprotective compounds based on their efficacy in reducing or preventing the deleterious effects of oxidative stress in ONHAs. We formulated the following five specific aims to reach our objective: 1) optimization of the isolation and culturing techniques for primary rat ONHAs; 2) development and validation of a lactate dehydrogenase (LDH) release assay for ONHAs; 3) optimization of chemically-induced oxidative stress to use as an insult in primary rat ONHAs; 4) evaluation of the effects of oxidative stress and hyperbaric pressure on ONHAs; 5) validation of the glioprotective screening platform using antioxidants in primary rat ONHA culture. We devised a novel protocol for the primary culture of ONHAs derived from adult rats and identified the optimal culture and seeding conditions for the experiments conducted in this thesis. In order to validate the astrocytic identity of the obtained primary cultures, expression of astrocyte specific markers (excitatory amino acid transporter 1 (EAAT1), glial fibrillary acidic protein (GFAP), and the glial calcium binding protein S100β) was confirmed by immunocytochemistry. Minimal to no contamination by other cell types was found. We next developed a protocol for a custom LDH assay as biotechnological platform for the screening of glioprotective compounds using chemically-induced oxidative stress, tert-butylhydroperoxide (tBHP), as an inducer of reactive oxygen species (ROS). Our comparison of the newly developed LDH release assay with a commercially available test kit revealed no statistically significant differences in sensitivity while being far less expensive when compared to the commercial assay. Another important advantage of our custom protocol is the ability to refine the protocol for specific compounds given the known formulation of all reagents. Next, we optimized the conditions for the use of tBHP as an inducer of oxidative stress in primary rat ONHA culture. The generation of ROS was confirmed using a fluorescent ROS sensor, 2',7'–dichlorofluorescein diacetate (DCFDA). tBHP-induced oxidative stress resulted in a dose-dependent loss of cell viability that was assessed using three different assays, each quantifying a different physiological mechanism that can serve as correlate of cell viability: calcein-AM uptake test, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide (MTT) assay and LDH assay. Data from calcein-AM uptake test and MTT assay were compared to the results of the newly developed LDH assay. All three assays yielded similar EC50/IC50 values for tBHP. Therefore, screening of glioprotective compounds using the developed LDH assay is predicted to provide an accurate reflection of the effects of compounds on the physiological function and survival of ONHAs. Lastly, we validated our biotechnological LDH assay platform for the screening of glioprotective compounds using the prototypic antioxidant Trolox and the nutraceutical Resveratrol. Both compounds exerted potent glioprotective effects with no statistically significant difference between EC50/IC50 values for tBHP obtained from LDH and MTT assays. In conclusion, we developed and validated a standardized biotechnological screening platform for the quantitative assessment of glioprotective properties in primary adult rat ONHA culture. We recommend the use of our standardized screening platform for advancing the development of novel glioprotective therapeutic strategies for the management of glaucoma.en
dc.description.abstractruВ диссертации представлены результаты разработки и оптимизации платформы скрининга глиопротекторных средств для лечения глаукомы. Для создания модельной системы тестирования глиопротекции был разработан протокол получения и культивирования первичных астроцитов головки зрительного нерва (АГЗН) с подтвержденными маркерами астроцитов. Для полученной культуры АГЗН были оптимизированы условия культивирования и покрытия поверхности. Была проведена модификация ЛДГ теста и его адаптация для полученной культуры АГЗН, в рамках которой были оптимизированы периоды инкубации с индуктором оксидативного стресса tBHP и тест-реагентами. Эффективность tBHP в качестве индуктора оксидативного стресса была подтверждена в тестах оценки уровня реактивных форм кислорода (РФК) и выживаемости клеток. Также было показано, что гипербарическое давление не влияет на выживаемость АГЗН, но при этом существенно повышает их чувствительность к оксидативному стрессу. Это позволило дальнейшее использования оксидативного стресса (tBHP) в качестве фактора влияния при тестировании средств глиопротекции. Наконец, была проведена сравнительная оценка разработанной ЛДГ системы с коммерческим тестом выживаемости клеток МТТ с использованием прототипного антиоксиданта Тролокса и нутрицевтика Ресвератрола. Значения EC50 (tBHP), полученные в ЛДГ и МТТ тестах, подтвердили точность разработанной системы.ru
dc.description.abstractukУ дисертації представлені результати розробки та оптимізації платформи скринінгу гліопротекторних засобів для лікування глаукоми. Для створення модельної системи тестування гліопротекції був розроблений протокол отримання і культивування первинних астроцитів голівки зорового нерву (АГЗН) з підтвердженими маркерами астроцитів. Для отриманої культури АГЗН були оптимізовані умови культивування та покриття 21поверхні. Була проведена модифікація ЛДГ тесту та його адаптація для отриманої культури АГЗН, в рамках якої були оптимізовані періоди інкубації з індуктором оксидативного стресу tBHP і тест-реагентами. Ефективність tBHP як індуктора оксидативного стресу була підтверджена в тестах оцінки рівня реактивних форм кисню (РФК) і виживання клітин. Також було показано, що гіпербарично тиск не впливає на виживаність АГЗН, але при цьому істотно підвищує їх чутливість до оксидативного стресу. Це уможливило подальше використання оксидативного стресу (tBHP) як патогенного фактору впливу при тестуванні засобів гліопротекціі. Нарешті, була проведена порівняльна оцінка розробленої ЛДГ системи з комерційним тестом виживання клітин МТТ з використанням прототипного антиоксиданта Тролокса та нутрціветика Ресвератролу. Значення EC50 (tBHP), отримані в ЛДГ і МТТ тестах, підтвердили точність розробленої системи.uk
dc.format.page26 с.uk
dc.identifier.citationНаумчук, Ю. А. Біотехнологічні основи лактатдегідрогеназної системи для тестування гліопротекторів астроцитів зорового нерву : автореф. дис. … канд. техн. наук : 03.00.20 – біотехнологія / Наумчук Юлія Анатоліївна. – Київ, 2018. – 26 с.uk
dc.identifier.urihttps://ela.kpi.ua/handle/123456789/24564
dc.language.isoukuk
dc.publisherКПІ ім. Ігоря Сікорськогоuk
dc.publisher.placeКиївuk
dc.subjectглаукомаuk
dc.subjectастроцити голівки зорового нервуuk
dc.subjectлактатдегідрогеназний тестuk
dc.subjectоксидативний стресuk
dc.subjectгліопротекціяuk
dc.subjectglaucomaen
dc.subjectoptic nerve head astrocytesen
dc.subjectlactatdehydrogenase assayen
dc.subjectoxidative stressen
dc.subjectglioprotectionen
dc.subjectглаукомаru
dc.subjectастроциты головки зрительного нерваru
dc.subjectлактатдегидрогеназный тестru
dc.subjectоксидативный стрессru
dc.subjectглиопротекцияru
dc.subject.udc617.731+612.843]:616.08](043.3) 616.7-007.681:616.08](043.3)uk
dc.titleБіотехнологічні основи лактатдегідрогеназної системи для тестування гліопротекторів астроцитів зорового нервуuk
dc.typeThesisuk

Файли

Контейнер файлів
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз
Назва:
Naumchuk_aref.pdf
Розмір:
1.6 MB
Формат:
Adobe Portable Document Format
Опис:
Завантажити
Ліцензійна угода
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз недоступний
Назва:
license.txt
Розмір:
7.74 KB
Формат:
Item-specific license agreed upon to submission
Опис:
Завантажити

Зібрання

Автореферати (БМІ)
Автореферати (вільний доступ)