Біотехнологія та біоаналітична стандартизація засобів імуноферментної діагностики
| dc.contributor.author | Галкін, Олександр Юрійович | |
| dc.contributor.degreedepartment | промислової біотехнології | uk |
| dc.contributor.degreefaculty | біотехнології і біотехніки | uk |
| dc.contributor.degreegrantor | Національний технічний університет України "Київський політехнічний інститут" | uk |
| dc.date.accessioned | 2015-12-16T07:46:24Z | |
| dc.date.available | 2015-12-16T07:46:24Z | |
| dc.date.issued | 2015 | |
| dc.description.abstracten | Thesis for a doctor degree, specialty 03.00.20 – biotechnology. – National Technical University of Ukraine “Kiev Polytechnic Institute” of Ministry of Education and Science of Ukraine, Kiev, 2015. The thesis presents the results of a scientific study of biotechnology of creation of highly informative ELISA diagnostic tests and bioanalytical parameters of standardization and validation of diagnostic products. Original sets of monoclonal antibodies to IgA, IgG and human IgE, horseradish peroxidase (HRP), the main protein of the outer membrane Ch. trachomatis was obtained, and the possibility of their use for the development of various modifications high informative ELISA and/or immunoaffinity chromatography was proved. The study of the biological properties of antibodies and epitope characteristics of the corresponding antigens was performed. Consistent pattern of humoral immune response in Balb/c and NZB mice to HRP was studied. Improved methods of obtaining of preparations of human IgE, Fc-fragments of IgG and IgA were developed. Optimal parameters of biotechnology production of recombinant Ch. trachomatis heat shock protein (rHSP-60) was determined. It was proved the stimulating effect of Clivia miniata and Zephyranthes grandiflora extracts on rHSP-60 biosynthesis in E. coli bacteria. The possibility of using the obtained immunosorbents, immuno-conjugates, Ch. trachomatis rHSP-60 to develop highly informative ELISA kits was proved. It was shown that in the serum from Ch. trachomatis infected persons contains idiotypic antibodies with anti-HSP-60 activity, which is one of the causes of false negative results. It was proved high activity of the hybrid positive control for IgM-«capture» ELISA kits, as well as for the detection of IgM and IgA antibodies to Ch. trachomatis (indirect ELISA). The parameters of standardization and validation characteristics of serodiagnostics tests were justified. Scientific and methodological recommendations on the validation of different types of ELISA were formed. | uk |
| dc.description.abstractru | Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. – Национальный технический университет Украины «Киевский политехнический институт» Министерства образования и науки Украины, г. Киев, 2015 год. В диссертации приведены теоретическое обобщение и новые пути решения научной проблемы, касающейся научного обоснования биотехнологии создания высокоинформативных средств иммуноферментной диагностики, параметров их биоаналитической стандартизации и валидации. Получены оригинальные наборы новых моноклональных антител (МАТ) к IgА человека, IgG человека, IgE человека, фермента пероксидазы хрена (HRP), основного белка внешней мембраны (МОМР) Ch. trachomatis, и доказана возможность их применения для разработки различных модификаций высокоинформативного ИФА и/или иммуноаффинной хроматографии. С помощью полученных МАТ установлено эпитопную структуру соответствующих инфекционных и неинфекционных антигенов, что открыло возможности для повышения эффективности иммунохимических методов диагностики, выделения и очистки биомолекул. Показано, что эпитопная структура молекул IgA, IgG и IgE человека содержит 2 основных иммунодоминантных эпитопных региона (ЭР), каждый из которых представлен 1-3 эпитопами. Установлена способность пяти анти-МОМР Ch. trachomatis МАТ конкурировать с поликлональными антителами (ПАТ) сыворотки лиц, инфицированных Ch. trachomatis. Антигенные детерминанты (АД) для МАТ 293F4 и 291F8, активно конкурирующие с ПАТ, представленные двумя линейными последовательностями 320-325 а.о. и 326-330 а.о., соответственно; эпитоп, с которым взаимодействует МАТ 296G2 (не проявляет активной конкуренции с ПАТ), представлен линейной последовательностью 347-352 а.о. Установлено, что анти-HRP МАТ направлены к пяти ЭР: 3 из них представлены АД белкового происхождения и 2 имеют углеводную природу. Активность МАТ, специфичных к углеводной части, выше по сравнению с МАТ, которые взаимодействуют с полипептидной цепью фермента; углеводный компонент HRP является более иммуногенным. На основе биохимических и физико-химических методов разработаны усовершенствованные методики получения высокоочищенных препаратов IgЕ человека, Fc-фрагментов IgG и IgA, а также хорошо воспроизводимую и простую в исполнении методику специфичного выделения IgE человека с использованием иммуноаффинных сорбентов на основе тетраэтоксисилана и сефарозы. Обоснованы оптимальные параметры биотехнологии получения и очистки рекомбинантного белка теплового шока (rHSP-60) Ch. trachomatis, что позволило получить последний с высокой иммунологической активностью in vitro. rHSP-60 накапливается как в цитоплазме E. coli штамма BL21 (DE3) в растворимом виде (79%), так и в виде телец-включений. Установлены оптимальные условия культивирования штамма-продуцента (среда LB, 37 °С, 0,3 ммоль ИПТГ, продолжительность биосинтеза 3 ч) и разработаны аффинную методику очистки целевого продукта. Доказано стимулирующее действие экстрактов кливии киноварной и зефирантеса крупноцветкового на биосинтез rHSP-60 бактериями E. coli в диапазоне 0,5-1,0%. Установлено, что биологически активные вещества исследованных экстрактов взаимодействуют с поверхностными структурами бактериальной клетки – поринами и порин-подобными белками. Доказана возможность использования полученных иммуносорбенетов, иммуноферментных конъюгатов МАТ, rHSP-60 Ch. trachomatis для разработки высокоинформативных ИФА-наборов: для количественного определения общего IgE человека, для выявления специфических IgE-антител к Ch. trachomatis и белка-аллергена пыльцы березы профилина, для выявления антител классов IgG и IgA к белкам МОМР и Pgp3 Ch. trachomatis и антител класса IgG к HSP- 60 Ch. trachomatis. Обоснована возможность и целесообразность применения аналит-опосредованной фермент-активирующей системы амплификации сигнала в ИФА для определения сверхмалых концентраций биоаналитов. Теоретически обосновано влияние макрокинетической составляющей реакции конъюгации и экспериментально определены оптимальные условия синтеза конъюгатов «белок-белок» и «белок-гаптен» для различных модификаций высокочувствительного ИФА. Показано, что в сыворотках крови лиц инфицированных Ch. trachomatis содержатся антиидиотипические антитела с анти-HSP-60 активностью, являющиеся причиной ложноотрицательных результатов ИФА-тестов. Доказана высокая активность гибридных положительных контролей для ИФА-наборов, построенных по принципу IgM-«ловушки» (на основе анти-HRP МАТ и нормального IgM), а также предназначенных для выявления IgM и IgA антител к Ch. trachomatis в непрямом ИФА (на основе анти-МОМР Ch. trachomatis МАТ и нормального IgM/IgA), что открыло возможности для повышения эффективности производства ИФА-диагностикумов. Научно обоснованные параметры стандартизации и валидационные характеристики средств серологической диагностики, а также сформированы научно-методические рекомендации по валидации различных типов ИФА, необходимые при сертификации средств для in vitro диагностики. | uk |
| dc.description.abstractuk | Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Національний технічний університет України «КПІ» Міністерства освіти і науки України, м. Київ, 2015 рік. У дисертаційній роботі представлені результати наукового обґрунтування біотехнології створення високоінформативних засобів імуноферментної діагностики та параметрів біоаналітичної стандартизації і валідації діагностичних препаратів. Одержано оригінальні набори моноклональних антитіл до IgА, IgG та IgE людини, пероксидази хрону (HRP), основного білку зовнішньої мембрани Ch. trachomatis, та доведено можливість їх застосування для розробки різних модифікацій високоінформативного ІФА та/або імуноафінної хроматографії. Розроблено удосконалені методики отримання високоочищених препаратів IgЕ людини, Fc-фрагментів IgG та IgA, методику специфічного виділення IgE із використанням імуноафінних сорбентів. Обґрунтовано оптимальні параметри біотехнології отримання рекомбінантного білку теплового шоку (rHSP-60) Ch. trachomatis. Доведено стимулюючу дію екстрактів клівії кіноварної і зефірантесу великоквіткового на біосинтез rHSP-60 бактеріями E. coli. Доведено можливість використання отриманих імуносорбенетів, імуноферментних кон’югатів, rHSP-60 Ch. trachomatis для розробки високоінформативних ІФА- наборів. Обґрунтовано доцільність застосування аналіт-опосередкованої фермент-активуючої системи ампліфікації сигналу у ІФА для визначення надмалих концентрацій біоаналітів. Визначено оптимальні умови синтезу кон’югатів «білок-білок» та «білок-гаптен» для різних модифікацій високочутливого ІФА. Показано, що у сироватках крові інфікованих Ch. trachomatis осіб місяться антиідіотипові антитіла із анти-HSP-60 активністю, що є однією із причин хибнонегативних результатів. Доведено високу активність гібридних позитивних контролів для ІФА-наборів, що побудовані за принципом IgM-«пастки», а також призначені для виявлення IgM та IgA антитіл до Ch. trachomatis у непрямому ІФА. Обґрунтовано параметри стандартизації та валідаційні характеристики засобів серодіагностики, сформовано науково-методичні рекомендації щодо валідації різних типів ІФА. | uk |
| dc.format.page | 47 c. | uk |
| dc.identifier.uri | https://ela.kpi.ua/handle/123456789/14341 | |
| dc.language.iso | uk | uk |
| dc.publisher | Національний технічний університет України "Київський політехнічний інститут" | uk |
| dc.publisher.place | Київ | uk |
| dc.status.pub | published | uk |
| dc.subject.udc | 573.6.083.3 | uk |
| dc.subject.udc | 573.6.086.8 | |
| dc.title | Біотехнологія та біоаналітична стандартизація засобів імуноферментної діагностики | uk |
| dc.type | Other | uk |
| thesis.degree.level | doctor | uk |
| thesis.degree.name | доктор біологічних наук | uk |
| thesis.degree.speciality | 03.00.20 – біотехнологія | uk |