Кафедра трансляційної медичної біоінженерії (ТМБ)

Постійне посилання на фонд

https://ela.kpi.ua/handle/123456789/36156

Переглянути

Перегляд Кафедра трансляційної медичної біоінженерії (ТМБ) за Автор "Архипова, Марина Андріївна"

Зараз показуємо 1 - 1 з 1
  • Ескіз
    ДокументВідкритий доступ
    Вивчення молекулярних механізмів противірусної активності флавоноїдів
    (КПІ ім. Ігоря Сікорського, 2024) Архипова, Марина Андріївна; Галкін, Олександр Юрійович; Рибалко, Світлана Леонтіївна
    Архипова М.А. Вивчення молекулярних механізмів противірусної активності флавоноїдів. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 – Біологія. – Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського», Київ, 2024. У дисертаційній роботі представлені результати дослідження противірусних властивостей комплексного фітопрепарату та його активних фармакологічних інгредієнтів, встановлення механізмів його антивірусної дії. Однією з основних задач сучасної фармації є пошук нових лікарських препаратів на основі рослинних компонентів. Серед таких рослинних речовин флавоноїди є перспективним джерелом біологічно активних сполук з широким спектром дії, зокрема з противірусними властивостями. Молекулярні механізми їхньої противірусної дії, головним чином, полягають у блокуванні ферментів, що беруть участь у реплікації вірусів, таких як нейрамінідаза, протеаза і ДНК/РНКполімераза, а також у модифікації вірусних білків. Комбінування різних флавоноїдів або їх поєднання з синтетичними противірусними препаратами може збільшити їхню ефективність в боротьбі з вірусами. Стратегії доставки ліків, що базуються на флавоноїдах, значно покращують їхню біодоступність. Поява нових вірусних інфекцій з високою вірулентністю та пандемічним поширенням підкреслює необхідність розробки нових противірусних засобів, серед яких флавоноїдні речовини виявляються перспективними. Оцінка противірусної активності коктейлю флавоноїдів може бути корисною для профілактики вірусних інфекцій та покращення сучасної противірусної терапії. Одним з таких комплексних лікарських препаратів рослинного походження є фітопрепарат на основі лікарських рослин Filipendula vulgaris, Petroselinum crispum, Apium graveolens, Galium verum, Linaria vulgaris, Calendula officinalis. Слід зазначити, що лікарські рослини, що складають основу фітопрепарату, містять низку біологічно активних речовин флавоноїдної природи. Тому актуальним є проведення дослідження антивірусної активності та молекулярних механізмів противірусної активності фітопрепарату та його активних фармацевтичних інгредієнтів. Перший розділ дисертаційної роботи «Огляд літератури» включає аналіз ролі флавоноїдів в інгібуванні репродукції вірусів, механізмів дії активних флавоноїдних інгредієнтів та їх клінічного значення, а також розгляд потенційних мішеней антивірусної дії рецептору епідермального фактору росту HER-2 та транскрипційного фактору Nrf2. У другому розділі «Матеріали та методи» описані використані матеріали, середовища, реактиви, культури клітин, віруси та тест-системи. Подано методи, використані у дослідженні, такі як визначення концентрації білку, культивування клітин, визначення цитотоксичної та ефективної концентрації препаратів, аналіз впливу на репродукцію вірусу, інтерфероногенну активність та експресію генів фактору транскрипції Nrf2 та епідермального фактору росту HER-2. У третьому розділі розглядається дослідження антивірусної активності фітопрепарату та його флавоноїдних компонентів на моделях герпетичної, коронавірусної інфекції, а також вірусу папіломи людини. Спиртовий розчин фітопрепарату є активним інгібітором реплікації вірусів простого герпесу 1 та 2 типів з індексом селективності 178 для ВПГ-1, 89 для ВПГ-2; 110 для та коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней, 320 для моделі вірусу гепатиту С та 31 для вірусу папіломи людини. Ефективні концентрації фітопрепарату у формі спиртового розчину (EC50) за концентрацією поліфенольних сполук становили: 0,31 мкг/мл для ВПГ-1 та вірусу гепатиту С; 0,63 мкг/мл для ВПГ-2 та коронавірусу ТГС; 62,5 мкг/мл для вірусу папіломи людини, що характеризує фітопрепарат у формі спиртового розчину як перспективний антивірусний препарат. Для фітопрепарату у формі екстракту та капсул значення індексу селективності дорівнювало 500 для вірусу простого герпесу 1 та 2 типів, при ефективній концентрації 0,125 мкг/мл, що характеризує його як активний антигерпетичний препарат. А на моделі коронавірусу ТГС індекс селективності становив 125 для екстракту, 250 для капсульної маси, при ефективній концентрації 0,63 мкг/мл. При дослідженні фітопрепарату у формі екстракту та капсул на моделі продукуючої вірус папіломи людини культурі клітин HeLa значення ефективної концентрації були 2 мкг/мл, індексу селективності – 31. Отримані результати вказують на більш активну антивірусну дію фітопрепарату у формі екстракту і капсул, ніж фітопрепарату у формі спиртового розчину. В результаті експериментальних досліджень доведено ефективність фітопрепарату в лікуванні генітального герпесу. На моделі генітального герпесу морських свинок показано, що фітопрепарат при комбінованому режимі (per os + аплікація) відстрочує появу перших симптомів і скорочує час перебігу захворювання. Індекс ефективності лікувальної дії фітопрепарату на рівні протигерпетичного препарату ацикловіру. У четвертому розділі «Механізми противірусної дії фітопрепарату та його активних флавоноїдних компонентів» доведено, що антивірусна активність препарату реалізується за рахунок молекулярних механізмів, таких як інгібування РНК- та ДНК-синтезу, індукції інтерферону, апоптозмоделюючої активності, інгібіції генів ВПГ-1 та коронавірусу ТГС, а також моделювання експресії генів Nrf2 та HER-2. Було встановлено інгібуючий вплив фітопрепарату на синтез РНК та ДНК. Для дослідження впливу на синтез РНК використовувалася модельна система транскрипції на основі ДНК-залежної РНК-полімерази фагу Т7 (РНКП Т7), яка є ефективною та зручною у використанні. В результаті експерименту було показано, що фітопрепарат блокує синтез РНК in vitro. За допомогою обраної для дослідження впливу фітопрепарату на синтез ДНК ПЛР-РЧ системи визначення експресії гена GAPDH з клітинної лінії К562, було встановлено, що фітопрепарат має інгібуючий вплив на експресію гена GAPDH, що свідчить про його здатність впливати на синтез ДНК. Доведено, що перспективний лікувальний противірусний потенціал досліджуваних форм фітопрепарату реалізується також через імуномодулюючий вплив шляхом індукції a-інтерферону. Встановлено, що інтерферон, індукований досліджуваним фітопрепаратом, можна класифікувати як a-інтерферон. Рівень індукції ендогенного a-інтерферону досліджуваним фітопрепаратом подібний до ефекту, який спричиняє референтний препарат поліінозинової-поліцитидилової кислоти. Показано, що у клітинах Jurkat, які були інфіковані вірусом простого герпесу 1 типу (ВПГ-1), спостерігалося значне збільшення апоптозу – на понад 30% у порівнянні з інтактною культурою клітин. Також відзначалося зниження вмісту клітин у фазі S та збільшення вмісту клітин у фазі G2/M. Використання фітопрепарату помітно знижувало вміст апоптотичних клітин, а також нормалізувало розподіл клітин за фазами клітинного циклу. У дослідженні впливу фітопрепарату на гени вірусу простого герпесу UL10, UL23, UL30, UL1, UL48 методом ПЛР, вперше було встановлено, що фітопрепарат, а також синтетичний флавоноїд апігенін, інгібували експресію гена UL10, який кодує глікопротеїн М, необхідний для реплікації вірусу в культурі клітин. Методом молекулярного докінгу показано, що флавоноїдні компоненти фітопрепарату, такі як кверцетин, лютеолін та апігенін, виявили здатність ефективно взаємодіяти з важливими компонентами вірусу SARS-CoV-2. Вони успішно утворювали комплекси з білково-нуклеїновим комплексом NSP16-NSP10-РНК, метилтрансферазою, основною протеазою та РНК-залежною РНКполімеразою. Аналіз взаємодії показав, що ці інгібітори блокують активність ферментів вірусу, завдяки розміщенню у важливих регуляторних кишенях або блокуванню каталітичної діади, що вказує на потенційну антивірусну активність досліджуваних інгібіторів проти SARS-CoV-2. За результатами дослідження вплив фітопрепарату у формі спиртового розчину та його активних флавоноїдних компонентів на експресію генів коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС) встановлено, що фітопрепарат та його активні компоненти – апігенін і тетраметоксикверцетин інгібують експресію генів ORF1a та ORF3b коронавірусу ТГС. Отримані результати свідчать про те, що механізм антивірусної дії фітопрепарату, як можливого антикоронавірусного агента, відбувається за рахунок інгібування генів і відкривають перспективи подальших досліджень у напрямку створення антикоронавірусного препарату. Результати молекулярного докінгу флавоноїдних компонентів фітопрепарату до сайтів зв'язування гелікази папіломавірусу людини вказують на потенційну можливість цих сполук впливати на репродукцію вірусу. Зокрема, тетраметоксикверцетин продемонстрував змінений зразок зв'язування до гелікази папіломавірусу, відмінний від кверцетину та інших аналогів. Це свідчить про те, що тетраметоксикверцетин може мати унікальну взаємодію з геліказою папіломавірусу, що може вплинути на його активність та можливості репродукції. У дослідженні впливу фітопрепарату на експресію гену транскрипційного фактору Nrf2 in vitro в клітинах Jurkat методом ПЛР було встановлено, що інфікування коронавірусом ТГС та ВПГ-1 призвело до незначного зменшення експресії гену транскрипційного фактору Nrf2, але у клітинах, оброблених фітопрепаратом та інфікованих вірусами ТГС та ВПГ-1 рівень експресії гену транскрипційного фактору Nrf2 збільшувався. Вплив фітопрепарату та синтетичних флавоноїдів на експресію гена рецептора епідермального фактора росту HER-2 у клітинах Jurkat, інфікованих клітин вірусом простого герпесу 1 типу призводив до збільшення рівня експресії ДНК рецептора епідермального фактора росту HER-2 та до зменшення рівня експресії мРНК рецептора епідермального фактора росту HER-2. Однак обробка клітин фітопрепаратом спричинила зменшення цього показника. Транскрипційний аналіз експресії гена рецептора епідермального фактора росту HER-2 після обробки клітин фітопрепаратом та синтетичними флавоноїдами показав, що інфікування клітин цим вірусом не суттєво впливає на рівень мРНК рецептора епідермального фактора росту HER-2. Обробка клітин фітопрепаратом та синтетичними флавоноїдами призвела до зменшення рівня мРНК рецептора епідермального фактора росту HER-2, особливо вираженого у випадку фітопрепарату. У п'ятому розділі було проведено аналіз та узагальнення результатів. Отримані та проаналізовані результати вказують на перспективність подальших досліджень фітопрепарату в якості протигерпетичного, протикоронавірусного та протипапіломавірусного препарату з полімішеневим механізмом антивірусної дії.