Визначення вірусостійкості трансгенних рослин родини Solanaceae, трансформованих гетерологічними генами

Скорочена інформація про документ
dc.contributor.advisorМатвєєва, Надія Анатоліївна
dc.contributor.authorПотрохов, Андрій Олександрович
dc.date.accessioned2024-09-02T07:35:59Z
dc.date.available2024-09-02T07:35:59Z
dc.date.issued2024
dc.description.abstractПотрохов А.О. Визначення вірусостійкості трансгенних рослин родини Solanaceae, трансформованих гетерологічними генами. – Кваліфікаційна наукова праця правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 «біотехнологія» – Інститут клітиної біології та генетичної інженерії НАН України, Національний технічний університет України “Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського” МОН України, Київ, 2024. Дисертаційна робота присвячена дослідженню вірусостійких трансгенних рослин родини Solanaceae з різними гетерологічними генами. Мета та завдання дослідження. Вивчення вірусостійкості трансгенних рослин родини Solanaceae з гетерогічними перенесеними генами до РНК вмісних вірусів рослин. Об’єкт дослідження — вірусостійкість трансгенних рослини родини Solanaceae до РНК вірусів рослин. В роботі було досліджено можливість використання генів різного походження для створення вірусостійких трансгенних родини Solanaceae на прикладі рослин Nicotiana tabacum L, Nicotiana bethamiana L, Petunia×hybrida hort. ex E. Vilm. та Solanum tuberosum L. Такий вибір рослин обумовлений тим, що N. tabacum, N. bethamiana вважають ідеальними модельними об’єктами для вірусологічних та генетичних досліджень. Рослини Petunia×hybrida останнім часом набувають великого значення як новий модельний об’єкт досліджень, окрім того вони широко використовуюся в промисловому садівництві. Рослин S. tuberosum виступають в даних дослідженнях, як цінний промисловий вид, який є важливим для економіки України та світу. Автор зазначає, що трансформовані рослини петунії та картоплі були отримані раніше і взяті в дану роботу для вірусологічних досліджень. Автор особисто провів генетичну трансформацію рослини N. tabacum та N. bethamiana з використанням векторних конструкцій з генами inf-2b та ZRNase II. Трансгенні рослини N. bethamiana з геном ZRNase II були використані для створення модельної системи вірус-рослина та оцінки розвитку системної вірусної інфекції. В роботі представлено результати молекулярно-біологічних, біохімічних та вірусологічних досліджень. Інфікування рослин проводили, використовуючи вірус картоплі Y (PVY), вірус тютюнової мозаїки (TMV) та векторну конструкцію з елементами вірусу картоплі Х та флуоресцентного білка GFP. Використання векторної конструкції з елементами вірусу і репортерним білком GFP дозволило візуалізувати розповсюдження вірусу в трансгенних рослинах і оцінити розвиток системної реакції. На початкових етапах роботи методом агробактеріальної трансформації були отримані рослини N. tabacum з геном inf‒2b. Проведена полімеразно-ланцюгова реакція (ПЛР) підтвердила наявність цільового гена. Методом Кербера було показано, що екстракти трансгенних рослин з геном inf–2b виявляли активність інтерферону на культурі клітин перевивних тестикул поросят інфікованих вірусом везикулярного стоматиту. Незважаючи на активність білкового продукту гена inf–2b, після інфікування трансгенних рослин TMV не було виявлено ознак зміни розвитку інфекційного процесу. Трансгенні рослини N. tabacum з геном inf‒2b не характеризувалися зміненою віросостійкістю до фітовірусу. Однак, за рядом біохімічних параметрів, а саме змінами антиоксидантної активності (АОА) та перекисневого окислення ліпідів (ПОЛ) трансгенні рослини характеризувалися тенденцією до підвищення стресостійкості. Електронне мікроскопічне дослідження трансгенних рослин N. tabacum не виявило змін ультраструктури клітин у порівняні з ультраструктурою клітин рослин дикого типу. Генетична трансформація чужорідним геном не призводила до патології в клітинах рослин. Патологічні зміни в клітинах трансгенних рослин, які були інфіковані TMV не відрізнялися від змін в уражених клітинах рослинах дикого типу. Таким чином, було показано що, трансформація рослин тютюну геном inf–2b не призводила до змін вірусостійкості рослин, навіть незважаючи на противірусну активність екстрактів на культурі клітин тварин. В подальшому було досліджено можливість застосування інших генів, а саме генів рибонуклеаз, для створення віростійких рослин. Рослини S. tuberosum та Petunia×hybrida були взяті з колекції трансгенних рослин Інституту клітинної біології та генетичної інженерії. Методом ПЛР було підтверджено, що, незважаючи на тривале зберігання в колекції, досліджувані рослин зберігали цільові гени. В результаті були відібрані сорти картоплі Ласунак та Лугівська, лінії яких містили гени bov (ген отриманий з Bos taurus) та ZRNase II (ген отриманий з рослин Zinnia elegans), а також відібрані лінії гібридних сортів петунії М1 та Р5 з геном ZRNase II. ПЛР підтвердив наявність гена ZRNase II в трансформованих рослин N. benthamiana, які були отримані в процесі роботи. Подальші дослідження проводили з рослинами, які вирощувалися в грунті. Перед початком експериментів усі дослідні рослини були акліматизовані до умов ex vitro. В досліджуваних рослинах визначали загальну РНКазну активність. Було досліджено загальну РНКазну активність в трансгенних лініях сортів картоплі Лугівська та Ласунак та у рослинах дикого типу толерантного сорту Слов’янка. Аналіз показав, що серед вихідних рослин дикого типу найбільа активність виявлена в толерантному сорті Слов’янка. Виявлено, що в трансгенних рослинах загальна РНКазна активність була вищою порівняно з такою активністю у рослин дикого типу. В рослинах сорту Лугівська, що містять ген ZRNase II, активність була найвища серед усіх трансгенних рослин картоплі. Аналіз загальної РНКазної активності у рослинах Petunia hybrida виявив, що активність РНКазна була визою у трансгенних рослинах. Загальна активність РНКаз у різних трансгенних ліній сорту Р5 перевищувала в 1,83-2,10 рази активність в рослинах дикого типу. У трансгенних рослин М1 активність була в 1,34-1,85 рази вищою, ніж у рослин дикого типу. Було встановлено, що у рослинах N. benthamiana загальна активність РНКази у трансгенних рослин була у 4-6 разів вищаб ніж у рослин дикого типу. Для проведення аналізу чутливості рослин до вірусів проводили їх інфікування. Інфікування трансгенних рослини, проводили методом інокуляції вірусовмісного препарату PVY (картопля), або TMV (петунія) шляхом механічного втирання в поверхню листкової пластинки. В якості контролю використовували рослини дикого типу. Після появи виражених симптомів інфекції проводили їх візуальний аналіз. В контрольних рослинах S. tuberosum симптоми інфекції PVY включали: скручування нижніх листків, жовті плями на листках, некроз стебел і жилок, концентричні некрози, затримку росту. Серед вихідних рослин найменш виражені симптоми були в рослинах толерантного сорту Слов’янка. В трансгенних рослинах симптоматична картина була менш вираженою та була пролонгована. Трансгенні рослини S. tuberosum з геном ZRNase II продемонстрували відстрочені або менш помітні симптоми вірусної інфекції у порівнянні з трансгенними рослинами з геном bov. Рослини Petunia hybrida дикого типу, інфіковані TMV, вже на третій тиждень почали проявляти симптоми ураження: мозаїка на листі, крапчастість, деформація листкових пластинок. Причому симптоми були більш яскраво виражені у рослин сорту М1. Симптоматична картина інфекції для сорту Р5 виражалася лише у легкій зморшкуватості листя. В трансгенних рослинах М1 та Р5 симптоми почали з’являтися лише на 4-5 тиждень. Оскільки візуальна діагностика не може вважатися надійним ефективним методом детекції вірусів, для достовірного підтвердження ураження рослин було проведено імуноферментний аналіз (ІФА). Визначення антигенів PVY проводили в модифікації «сендвіч» ІФА. Результати аналізу виявили різні рівні накопичення вірусного антигена. Найбільш чутливим був сорт Ласунак, а найбільш толерантним – Слов’янка. В дослідних лініях трансгенних рослин з геном bov достовірної різниці у рівні вірусних антигенів порівняні з рослинами дикого типу виявлено не було. У трансгенних рослин сорту Лугівська з геном ZRNase II рівень накопичення вірусу був найнижчий серед усіх досліджуваних рослин. Накопичення вірусного антигена TMV в рослинах петунії аналізували методом непрямого ІФА. У трансгенних лініях сорту M1 кількість вірусного антигена була у 3,3 – 4,0 менша ніж у вихідних рослин дикого типу. В рослинах сорту P5 кількість антигена була у 1,62 рази менше порівняно з контролем. Як і рослини N. tabacum, рослини петунії за біохімічними показниками ПОЛ та АОА проявляли тенденцію до розвитку стресостійкості до вірусної інфекціїБ викликаної TMV. В інфікованих рослинах дикого типу, фітовірусна інфекція спричинювала стимулювання ПОЛ та активацію метаболічних процесів та розвиток стрес-реакцій. В 7 трансгенних рослинах спостерігали активізацію процесів АОА та розвиток захисних реакцій. Оскільки рослини Petunia×hybrida не дають чітко вираженої системної реакції TMV для дослідження впливу гена ZRNase II на системне поширення вірусів в трансгенних рослинах була розроблена тест система вірус-рослина з використанням модельних рослин N. bethamiana з геном ZRNase II. В трансгенні рослини N. benthamiana з геном ZRNase II була інфільтрована векторна конструкція, що містила в своєму складі елементи вірусу картоплі Х та репортерний ген gfp. Продукт гена gfp можна візуально ідентифікувати в ультрафіолетовому спектрі, що дозволяє оцінити розповсюдження вірусу по рослині у реальному часі. В результаті дослідження було встановлено, що світіння GFP спочатку з’являлося в сайті первинної інфільтрації. Системне поширення вірусних частинок в рослинах дикого типу спостерігали на другий тиждень після інфільтрації. GFP детектували в молодих листках, судинних пучках, зокрема в районі центральних та бічних жилокок. В трансгенних лініях рослин розвиток системної вірусної реакції був сповільнений. В цих рослинах було відміченою появу нових сигналів в місцях, відмінних від первинної зони інфільтрації, через 2-3 тижнів після візуалізації активної флуоресценції в рослинах дикого типу. Аналіз співвідношення антоціанів до хлорофілів в системі вірусрослина показав, що в трансгенних рослинах цей показник був в 2 рази нижчим порівняно з рослинами дикого типу. Це може бути свідченням більш ефективної роботи антиоксидантної систем в трансгенних лініях тютюну. Таким чином, в результаті проведеної роботи було встановлено, що на відміну від використання гена inf 2b, гени екстраклітиних рибонуклеаз дозволяють отримувати рослини з модифікованою стійкістю до вірусів. У таких трансгенних рослин пригнічуєтеся розвиток вірусної інфекції, хоча і не спостерігається повна його елімінація. З представлених в даному дослідженні підходів оптимальним є використанням генів рибонулеаз рослинного походження.
dc.description.abstractotherPotrokhov A.O. «Determination of virus resistance of transgenic plants of the Solanaceae transformed with heterologous genes». – Qualifying research paper on manuscript rights. Dissertation for obtaining the scientific degree of candidate of biological sciences in the specialty 03.00.20 "biotechnology". – Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of the National Academy of Sciences of Ukraine, National Technical University of Ukraine "Ihor Sikorsky Kyiv Polytechnic Institute" of the Ministry of Education and Culture of Ukraine, Kyiv, 2024. The dissertation is devoted to the study of virus-resistant transgenic plants of the Solanaceae with various heterologous genes. The purpose of the work is to study the virus resistance of transgenic plants of the Solanaceae with various heterologous genes. The object of the research is the virus resistance of a plant of the Solanaceae. The paper investigated the possibility of using genes of different origins to create virus-resistant transgenic Solanaceae plants: Nicotiana tabacum, Nicotiana bethamiana, Petunia×hybrida and Solanum tuberosum. N. tabacum, N. bethamiana are considered ideal model objects for virological and genetic research. Petunia×hybrida plants have recently gained great importance as a new model object of research, in addition, they are widely used in industrial horticulture. S. tuberosum plants appear in these studies as a valuable industrial species. The author notes that transformed petunia and potato plants were obtained earlier and included in this work for virological research. The author personally carried out the genetic transformation of N. tabacum and N. bethamiana plants using vector constructs with inf-2b and ZRNase II genes. Transgenic plants of N. bethamiana with the ZRNase II gene were used to create a virus-plant model system and evaluate the development of systemic viral infection. The work presents the results of molecular biological, biochemical and virological research. At the initial stages of the work, N. tabacum plants with the inf-2b gene were obtained by the method of agrobacterial transformation. Polymerase chain reaction (PCR) confirmed the presence of the target gene. Using Kerber's method, it was shown that extracts of transgenic plants with the inf-2b gene showed interferon activity in the culture of cells of the testicles of piglets infected with the vesicular stomatitis virus. Despite the protein activity no signs of changes in the development TMV infection in transgenic plants were detected. Transgenic N. tabacum plants with the inf-2b gene were not characterized by altered resistance to the plant virus. However transgenic plants were characterized by a tendency to increase stress resistance, according to biochemical parameters (antioxidant activity (AOA) and lipid peroxidation (LPO)). Genetic transformation with a foreign gene did not lead to pathology in plant cells. Electron microscopic examination of transgenic N. tabacum did not reveal changes in the ultrastructure of cells compared to the ultrastructure of cells of wild-type plants. Pathological changes in transgenic cells that were infected by TMV did not differ from changes in infected cells of wild-type plants. Thus, it was shown that the transformation of tobacco plants with the infα2b gene did not lead to changes in plant virus resistance, even despite the antiviral activity of extracts on animal cell culture. The transgenic S. tuberosum and Petunia×hybrida plants were taken from plant collection of the Institute of Cell Biology and Genetic Engineering. PCR method confirmed the presence of the target gene. As a result, potato varieties Lasunak and Luhivska were selected, the lines of which contained bov genes (a gene obtained from Bos taurus) and ZRNase II (a gene obtained from Zinnia elegans plants), as well as lines of hybrid petunia varieties M1 and P5 with the ZRNase II gene were selected. In addition, PCR confirmed the presence of the ZRNase II gene in the transformed plants of N. benthamiana, which were obtained during the work. All experimental plants were acclimatized to ex vitro conditions. The total RNase activity was determined in the plants after acclimatization. The total RNase activity was investigated in transgenic lines of Luhivska and Lasunak and in wild-type plants of the tolerant variety Slovyanka. The analysis showed that among the original wild-type plants, the tolerant variety Slovianka showed the greatest activity. It was found that the total RNase activity in transgenic plants was higher compared to wild-type plants. In plants of the Luhivska containing the ZRNase II gene, the activity was the highest among all transgenic potato plants. The total RNase activity in transgenic Petunia×hybrida plants was higher than RNase activity in non-transgenic plants. In various transgenic lines of the P5 the activity was 1.83-2.10 higher than in wild-type plants. In transgenic M1 plants, the activity was 1.34-1.85 higher than in wild-type plants. RNase activity in transgenic N. benthamiana plants was 4-6 times higher than in wild-type plants. Transgenic plants were infected by PVY (potato) or TMV (petunia) by mechanical rubbing into the surface of the leaf blade. Wild-type plants were used as controls. After the appearance of pronounced symptoms of infection, they were visually analyzed. In control plants of S. tuberosum, symptoms of PVY infection included: curling of lower leaves, yellow spots on leaves, necrosis of stems and veins, concentric necrosis, and growth retardation. Among the starting plants, the least severe symptoms were in the plants of the tolerant variety Slovianka. In transgenic plants, the symptomatic picture was less pronounced and prolonged. Transgenic plants of S. tuberosum with the ZRNase II gene showed delayed or less severe symptoms of virus infection compared to transgenic plants with the bov gene. Wild-type Petunia×hybrida plants infected by TMV began to show damage symptoms already in the third week: leaf mosaic, speckling, deformation of leaf plates. Moreover, the symptoms were more pronounced in the M1 variety. The symptomatic picture of the infection for the P5 variety was expressed only in a slight wrinkling of the leaves. In transgenic plants M1 and P5, symptoms began to appear only after 4-5 weeks. Since visual diagnostics cannot be considered a reliable and effective method of virus detection, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to reliably confirm plant damage. Determination of PVY antigens was carried out in a modified "sandwich" ELISA. Based on the results of the analysis, different levels of viral antigen accumulation were observed. The most susceptible variety was Lasunak, and the most tolerant was Slovianka. In experimental lines of transgenic plants with the bov gene, no significant difference in the level of viral antigens compared to wild-type plants was found. In transgenic plants of the Luhivska with the ZRNase II gene, the level of virus accumulation was the lowest among all the studied plants. Accumulation of viral antigen TMV in petunia plants was analyzed by indirect ELISA. In the transgenic lines of the M1 variety, the amount of viral antigen was 3.3-4.0 less than in the original wild-type plants. In plants of the P5 variety, the amount of antigen was 1.62 times less compared to the control. Petunia plants showed a tendency to develop stress resistance to TMV virus infection according to the biochemical indicators of LPO and AOA. In infected wild-type plants, plant virus infection caused stimulation of LPO and activation of metabolic processes and development of stress responses. Activation of AOA processes and the development of protective reactions were observed in transgenic plants. Since Petunia×hybrida plants do not give a well-defined systemic response to TMV, a virus-plant test system using model plants N. bethamiana with the ZRNase II gene was developed to study the effect of the ZRNase II gene on the systemic spread of viruses in transgenic plants. A vector construct containing elements of the potato virus X and the gfp reporter gene was infiltrated into the transgenic N. benthamiana plant with the ZRNase II gene. The product of the gfp gene can be visually identified in the ultraviolet spectrum, which allows to assess the spread of the virus on the plant in real time. As a result of the study, it was established that GFP glow first appeared at the site of primary infiltration. Systemic spread of viral particles in wild-type plants was observed in the second week after infiltration. GFP was detected in young leaves, vascular bundles, in particular in the central and lateral veins. In transgenic plant lines, the development of the systemic virus reaction was slowed down. In these plants, the appearance of new signals in places other than the primary infiltration zone was noted 2-3 weeks after visualization of active fluorescence in wild-type plants. Analysis of the ratio of anthocyanins to chlorophylls in the virus-plant system showed that in transgenic plants this indicator was 2 times lower compared to wild-type plants. This may be evidence of more efficient work of antioxidant systems in transgenic tobacco lines. Thus, as a result of the work carried out, it was established that, unlike the use of the inf-2b gene, extracellular ribonuclease genes make it possible to obtain plants with modified resistance to viruses. In such transgenic plants, the development of viral infection is inhibited, although its complete elimination is not observed. Of the ones presented in this study methods, the use of ribonuase genes of plant origin is optimal.
dc.format.extent181 с.
dc.identifier.citationПотрохов, А. О. Визначення вірусостійкості трансгенних рослин родини Solanaceae, трансформованих гетерологічними генами : дис. … канд. біол. наук : 03.00.20 - біотехнологія / Потрохов Андрій Олександрович. – Київ, 2024. – 181 с.
dc.identifier.urihttps://ela.kpi.ua/handle/123456789/68625
dc.language.isouk
dc.publisherКПІ ім. Ігоря Сікорського
dc.publisher.placeКиїв
dc.subjectтрансгенні рослини
dc.subjectSolanaceae
dc.subjectстійкість до вірусів
dc.subjectсистемна вірусна реакція
dc.subjectгетерологічні гени
dc.subjecttransgenic plants
dc.subjectresistance to viruses
dc.subjectsystemic viral response
dc.subject.udc60.604
dc.titleВизначення вірусостійкості трансгенних рослин родини Solanaceae, трансформованих гетерологічними генами
dc.typeThesis Doctoral

Файли

Контейнер файлів
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз
Назва:
Potrokhov_dys.pdf
Розмір:
2.96 MB
Формат:
Adobe Portable Document Format
Завантажити
Ліцензійна угода
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз недоступний
Назва:
license.txt
Розмір:
8.98 KB
Формат:
Item-specific license agreed upon to submission
Опис:
Завантажити

Зібрання

Дисертації (вільний доступ)