Розроблення способів отримання різних субстанцій із молозива та дослідження їхньої біологічної активності
| dc.contributor.author | Іванов, Євген Геннадійович | |
| dc.date.accessioned | 2025-04-28T13:40:47Z | |
| dc.date.available | 2025-04-28T13:40:47Z | |
| dc.date.issued | 2025 | |
| dc.description.abstract | Іванов Є.Г. Розроблення способів отримання різних субстанцій із молозива та дослідження їхньої біологічної активності – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – Біотехнологія. – Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, 2025. Дисертацію присвячено розробці технології одержання та стандартизації різноманітних біологічно активних субстанцій із молозива, вивченню біологічних властивостей цих субстанцій. А саме дослідженню механізмів дії низькомолекулярних компонентів молозива на організм, та можливості їхнього використання як продуктів функціонального харчування, що сприяють усуненню токсичної дії іонів міді та покращують здатність тварин виконувати фізичні навантаження; дослідженню гепатотропної дії низькомолекулярних компонентів молозива на моделі фіброзу печінки; можливості використання отриманих комплексів міцел казеїну з поліфенольними сполуками у якості продуктів функціонального харчування. Молозиво отримували завжди в одному фермерському господарстві - "Альфа", що розташоване у с. Одноробівка, Золочівського району, Харківської області України, у корів породи "Українська чорно-ряба" у весняно-літній період, у яких не зафіксовано патологій, та після першого і другого надою. Після отримання молозиво охолоджували та доставляли в лабораторію, де воно охолоджувалося до - 15 °C та зберігалося не більше місяця. Розробили технологію яка дозволяла отримувати ліпідну фракцію, фракцію казеїну, яку висушували та зберігали за температури 4°С. Фракцію низькомолекулярних компонентів молозива та "ультрафільтрату", які висушували в ротаційному випаровувачі й так само зберігали в сухому вигляді. Перед використанням готували водні розчини відповідних субстанцій молозива. Харчову добавку "Мікс-фактор" одержували з клітинних культур Sacharomyces cerevisue та Pleurotus osteatus згідно з технічними умовами (www.miks.org/engine.com/engine.ua), який являє собою низькомолекулярні компоненти екзометаболітів цих культур та використовувався як аналог низькомолекулярних компонентів молозива при перевірці гіпотези про неспецифічну дію низькомолекулярних компонентів з різних біологічних джерел. Поліфенольні сполуки виділяли зі шроту соняшникового, як розроблено у нашій лабораторії [Bozhkov et al., 2024]. Дослідження біологічних властивостей отриманих субстанцій молозива були проведені на самцях щурів лінії Wistar, молодих 3 місячного і старих 20 місячного віку, а в спеціальних експериментах із дослідження "Мікс-фактору" дуже старих щурів - 22 і 33 місяців. Тварин утримували в стандартних умовах віварію з дотриманням загальних біоетичних принципів проведення експериментів на тваринах відповідно до "Загальних принципів роботи на тваринах", затверджених I Національним конгресом з біоетики [Київ, Україна, 2001] та узгоджених із положеннями "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються в експериментальних та інших наукових цілях" [Страсбург, Франція, 1985] та після схвалення біоетичним комітетом Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Дослідження на клітинному рівні проводили на первинних культурах клітин кісткового мозку щурів. При розробці методів біотестування компонентів молозива використовували культури мікроводоростей Dunaliella viridis. Оцінку антибактеріальної активності проводили за стандартними мікробіологічними методами на культурах Staphylococcus aureus 124 і Pseudomonas aeruginosa 18 [Bozhkov et al., 2024]. У роботі використовували фізіологічні методи дослідження: визначення динаміки маси тіла; температури тіла; здатності тварин виконувати роботу в тестах плавання з вантажем і час бігу в тредбані; поведінки тварин; динаміки маси внутрішніх організмів і деяких їхніх анатомічних особливостей (наявність сполучнотканинних спайок). Гістологічні зміни в тканині печінки. Під час аналізу складу білків молозива та його фракцій використовували метод масспектроскопії, а під час визначення кількості кальцію та ROS у клітинах кісткового мозку використовували конфокальну мікроскопію (мікроскоп конфокальний Olympus FV10i). Аналіз кількості іонів міді в досліджуваних зразках проводили за допомогою атомно-абсорбційної спектрометрії з електротермічною атомізацією на спектрофотометрі КАС-120 типу С-115-МІ. У роботі використовували різні біохімічні методи дослідження: визначення кількості білка, вуглеводів, нуклеїнових кислот, гідропероксидів ліпідів, тригліцеридів, холестерину та інші показники, активність ряду антиоксидантних ферментів. Статистичний аналіз результатів дослідження проводили з використанням t-критерію Стьюдента і критерію ANOVA (для непараметричних даних). Вірогідною вважали різницю при р≥0,95 (рівень значимості Р≤0,05). Показано високу варіабельність білкового складу молозива та запропоновано "селективно-інтегративну" технологію під час отримання базових субстанцій молозива (ліпіди, казеїн, низькомолекулярні компоненти молозива та "ультрафільтрата"), що дає змогу зменшити природну варіабельність складу субстанцій молозива, що є важливим за їхнього практичного використання. Розроблена технологія дозволяє часткову забезпечити стандартизацію отриманих компонентів молозива Результати роботи розширюють наші знання про механізми дії багатокомпонентних субстанцій на біологічні системи, які перебувають у різних функціональних станах (вікові особливості, токсикози, фібрози), і на прикладі низькомолекулярних компонентів молозива показано їхню поліфункціональність дії. Встановлено, що низькомолекулярні компоненти молозива здатні виконувати як специфічну, так і неспецифічну - горметичну дію на біологічні системи та це залежить від функціонального стану організму під час дії цих субстанцій. Встановлено відсутність токсичної дії низькомолекулярних компонентів молозива і лише за супервеликих доз (1-5 г/100г маси) має місце індивідуальна непереносимість, що проявляється в порушенні функції травлення. У роботі доведено, що низькомолекулярні компоненти молозива можуть проявляти властивості як прооксидантів, так і антиоксидантів і це залежить від їх дози. Важливо підкреслити, що в малих дозах (0,01-0,1 г/100 г маса тіла) низькомолекулярні компоненти молозива можуть виконувати функції антиоксидантів, а у великих дозах(1-3 г/100 г) прооксидантів. Такі здібності можуть пояснювати специфічність дії на патологічні стани організму і відсутність їх дії на організм якій перебував у тривалому гомеостатичному стані. Доведено, що механізм дії низькомолекулярних компонентів молозива реалізується шляхом корекції характеристик редокс-системи та запуску ієрархічної системи, регуляції на рівні функції печінки та кісткового мозку, а можливо й інших функціональних систем організму. Така системна регуляція метаболізму забезпечує поліфункціональну дію низькомолекулярних компонентів молозива. Доведено, що спрямованість дії компонентів молозива залежить не тільки від дози, а й від функціональних характеристик біологічної системи на момент дії біологічно активних компонентів молозива. Розроблено модель Сu-індукованого фіброзу печінки та доведено, що іони міді після багаторазових послідовних введень у організм, у дозі близько 30% від летальної, так само як і відома модель тетрахлорметану, спричиняють прояв окисного стресу, що й запускає розвиток фіброзу. Довели роль низькомолекулярних компонентів молозива в регуляції якісних і кількісних характеристик клітин кісткового мозку на моделі Сu-індукованого фіброзу печінки, що забезпечує корекцію функціональної активності клітинної ланки імунної системи при фіброзі печінки. Виявили взаємозв'язок між показниками редокс-системи, клітинної ланки імунітету та такими фізіологічними показниками, як відновлення росту маси тіла, температури тіла та працездатності у тварин з Сu-індукованого фіброзу печінки якій має місце у випадку дії низькомолекулярних компонентів молозива. Встановлено, що низькомолекулярні компоненти з інших біологічних джерел (Pleurotus ostreatus та Sacharomyces cerevisue), харчова добавка "Міксфактор", виявляли схожі з низькомолекулярними компонентами молозива ефекти на показники редокс-системи та фізіологічні показники тварин із фіброзом печінки, що підтверджує гіпотезу і про неспецифічний, горметичний механізм дії таких різних за природою низькомолекулярних компонентів біологічного походження. Виявили, що щоденне вживання "Мікс-фактора" з питною водою в малих дозах (0,05-0,06 мл/100 г маси тіла) на пізніх етапах онтогенезу щурів починаючи із 22 та навіть із 31 місячного віку, дещо зміщує криву природної смертності праворуч, а за вживання з 31 місячного віку збільшувало максимальну тривалість життя. Поряд з цим, встановлено, що "Мікс-фактора" покращує здатність старих тварин виконувати фізичні навантаження. Обґрунтували доцільність використання електропровідності молозива та його окремих фракцій (незбиране, знежирене молозиво, низькомолекулярні компоненти молозива) під час оцінки їхніх інтегративних характеристик, що дозволило запропонувати новий метод контролю при отриманні біологічно активних субстанцій з молозива і інших біологічних об'єктів. Розробили метод отримання поліфенольних сполук, збагачених хлорогеновою кислотою, та їх включення до складу казеїнових міцел молозива і показали, що у таких комплексах має місце перебудова білкової частини міцел казеїну. Довели перспективність використання цих комплексів у функціональному харчуванні. | |
| dc.description.abstractother | Ivanov E.G. Development of methods for obtaining various substances from colostrum and study of their biological activity - Qualification scientific work on the rights of a manuscript. Dissertation for the degree of Doctor of Biological Sciences (specialty 03.00.20 - Biotechnology) - V. N. Karazin Kharkiv National University, 2025. The dissertation is devoted to the development of technology for the production and standardisation of various biologically active substances from colostrum, and the study of the biological properties of these substances. Namely, the study of the mechanisms of action of low molecular weight colostrum components on the body and the possibility of their use as functional foods that help eliminate the toxic effects of copper ions and improve the ability of animals to perform physical activity; study of the hepatotropic effect of low molecular weight colostrum components on a model of liver fibrosis; the possibility of using the obtained complexes of casein micelles with polyphenolic compounds as functional foods. Colostrum was always obtained from the same farm - ‘Alpha’, located in the village of Odnorobivka, Zolochiv district, Kharkiv region of Ukraine, from cows of the Ukrainian Black-and-White breed in the spring and summer, in which no pathologies were recorded, and after the first and second milkings. After receiving colostrum, it was cooled and delivered to the laboratory, where it was cooled to -15 °C and stored for no more than a month. A technology was developed to obtain a lipid fraction, the casein fraction, which was dried and stored at 4°C. The fraction of low molecular weight colostrum components and ultrafiltrate was dried in a rotary evaporator and stored in the same way. Before use, aqueous solutions of the respective colostrum substances were prepared. The food additive ‘Mix-factor’ was obtained from cell cultures of Sacharomyces cerevisue and Pleurotus osteatus according to the technical specifications (www.miks.org/engine.com/engine.ua), which represents low-molecular weight components of exometabolites of these cultures and was used as an analogue of low-molecular weight components of colostrum when testing the hypothesis of the nonspecific effect of low-molecular weight components from various biological sources. Polyphenolic compounds were isolated from sunflower meal as developed in our laboratory (Bozhkov et al., 2024). Studies of the biological properties of the obtained colostrum substances were conducted on male Wistar rats, young 3 months and old 20 months of age, and in special experiments to study the ‘Mix-factor’ very old rats - 22 and 33 months. Animals were kept in standard vivarium conditions in compliance with the general bioethical principles of animal experimentation in accordance with the ‘General Principles for Animal Care and Use’ approved by the First National Congress on Bioethics [Kyiv, Ukraine, 2001] and in accordance with the provisions of the ‘European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes’ [Strasbourg, France, 1985] and after approval by the Bioethics Committee of V. N. Karazin Kharkiv National University. Cellular level studies were performed on primary cultures of rat bone marrow cells. Microalgae cultures of Dunaliella viridis were used to develop bioassay methods for colostrum components. The antibacterial activity was evaluated using standard microbiological methods on cultures of Staphylococcus aureus 124 and Pseudomonas aeruginosa 18 [Bozhkov A.I. et al.] Physiological research methods were used in the study: determination of body weight dynamics; body temperature; ability of animals to perform in the tests of swimming with a load and running time in the treadmill; animal behaviour; dynamics of the mass of internal organisms and some of their anatomical features (presence of connective tissue adhesions). Histological changes in liver tissue. Mass spectroscopy was used to analyse the composition of colostrum proteins and its fractions, and confocal microscopy (Olympus FV10i confocal microscope) was used to determine the amount of calcium and ROS in bone marrow cells. The amount of copper ions in the studied samples was analysed using atomic absorption spectrometry with electrothermal atomisation on a KAS-120 type C-115-MI spectrophotometer. Various biochemical methods were used in the study: determination of the amount of protein, carbohydrates, nucleic acids, lipid hydroperoxides, triglycerides, cholesterol and other indicators, and the activity of a number of antioxidant enzymes. Statistical analysis of the study results was performed using Student's t-test and ANOVA (for non-parametric data). The difference was considered significant at p≥0.95 (significance level P≤0.05). The high variability of the protein composition of colostrum was shown and a ‘selective-integrative’ technology was proposed for the production of basic colostrum substances (lipids, casein, low-molecular weight components of colostrum and ultrafiltrate), which allows reducing the natural variability of the composition of colostrum substances, which is important in their practical use. The developed technology allows us to partially ensure the standardisation of the obtained colostrum components The results of the work expand our knowledge of the mechanisms of action of multicomponent substances on biological systems in different functional states (agerelated features, toxicosis, fibrosis), and the example of low-molecular weight colostrum components shows their multifunctional action. It has been established that low-molecular weight colostrum components are capable of performing both specific and nonspecific hormetic effects on biological systems, and this depends on the functional state of the organism during the action of these substances. The absence of toxic effects of low-molecular weight colostrum components was established, and only at super-high doses (1-5 g/100g of weight) individual intolerance occurs, which manifests itself in impaired digestive function. The study proved that low-molecular weight colostrum components can exhibit the properties of both prooxidants and antioxidants, and this depends on their dose. It is important to emphasise that in low doses (0.01-0.1 g/100 g body weight), low-molecular weight colostrum components can act as antioxidants, and in high doses (1-3 g/100 g) as prooxidants. Such abilities may explain the specificity of their effect on pathological conditions of the body and the absence of their effect on the body of a woman in a prolonged homeostatic state. It is proved that the mechanism of action of low-molecular weight colostrum components is realised by correcting the characteristics of the redox system and launching a hierarchical system, regulating the function of the liver and bone marrow, and possibly other functional systems of the body. This systemic regulation of metabolism provides a multifunctional effect of low-molecular weight colostrum components. It has been proved that the direction of action of colostrum components depends not only on the dose, but also on the functional characteristics of the biological system at the time of exposure to biologically active colostrum components. A model of Cu-induced liver fibrosis was developed and it was proved that copper ions after multiple sequential injections into the body at a dose of about 30% of the lethal dose, as well as the well-known model of tetrachloromethane, cause oxidative stress, which triggers the development of fibrosis. The role of low-molecular weight colostrum components in regulating the qualitative and quantitative characteristics of bone marrow cells in a model of Cuinduced liver fibrosis was proved, which ensures the correction of the functional activity of the cellular part of the immune system in liver fibrosis. The correlation between the parameters of the redox system, the cellular immune system and such physiological parameters as recovery of body weight growth, body temperature and performance in animals with Cu-induced liver fibrosis was revealed, which occurs in the case of exposure to low molecular weight colostrum components. It was found that low molecular weight components from other biological sources (Pleurotus ostreatus and Sacharomyces cerevisue), the food supplement ‘Mix-factor’, had similar effects to low molecular weight components of colostrum on the redox system and physiological parameters of animals with liver fibrosis, which confirms the hypothesis of a nonspecific, hormonal mechanism of action of such different in nature low molecular weight components of biological origin. It was found that daily use of ‘Mix-factor’ with drinking water in small doses (0.05-0.06 ml/100 g of body weight) at the later stages of rat ontogeny, starting from 22 and even 31 months of age, slightly shifts the natural mortality curve to the right, and when used from 31 months of age, it increased the maximum life expectancy. At the same time, it was found that the ‘Mix-factor’ improves the ability of old animals to perform physical activity. The expediency of using the electrical conductivity of colostrum and its individual fractions (whole, skimmed colostrum, low-molecular weight colostrum components) in assessing their integrative characteristics was substantiated, which allowed us to propose a new control method for the production of biologically active substances from colostrum and other biological objects. We developed a method for the preparation of polyphenolic compounds enriched with chlorogenic acid and their incorporation into colostrum casein micelles and showed that such complexes restructure the protein part of casein micelles. The prospects for the use of these complexes in functional foods have been proved. | |
| dc.format.extent | 326 с. | |
| dc.identifier.citation | Іванов, Є. Г. Розроблення способів отримання різних субстанцій із молозива та дослідження їхньої біологічної активності : дис. … д-ра біол. наук : 03.00.20 - біотехнологія / Іванов Євген Геннадійович. – Харків, 2025. – 326 с. | |
| dc.identifier.uri | https://ela.kpi.ua/handle/123456789/73609 | |
| dc.language.iso | uk | |
| dc.publisher.place | Харків | |
| dc.subject | молозиво | |
| dc.subject | казеїн | |
| dc.subject | низькомолекулярні компоненти молозива | |
| dc.subject | інтоксикація | |
| dc.subject | фіброз печінки | |
| dc.subject | якість та тривалість життя | |
| dc.subject | антиоксиданти | |
| dc.subject | прооксиданти | |
| dc.subject | показники активності імунної системи | |
| dc.subject | кістковий мозок | |
| dc.subject | colostrum | |
| dc.subject | casein | |
| dc.subject | low-molecular weight colostrum components | |
| dc.subject | intoxication | |
| dc.subject | liver fibrosis | |
| dc.subject | quality and duration of life | |
| dc.subject | antioxidants | |
| dc.subject | prooxidants | |
| dc.subject | indicators of immune system activity | |
| dc.subject | bone marrow | |
| dc.subject.udc | 602.44:[613.292:612.664.3]:612.017(043.5) | |
| dc.title | Розроблення способів отримання різних субстанцій із молозива та дослідження їхньої біологічної активності | |
| dc.type | Thesis Doctoral |
Файли
Контейнер файлів
1 - 1 з 1
Ліцензійна угода
1 - 1 з 1
Ескіз недоступний
- Назва:
- license.txt
- Розмір:
- 8.98 KB
- Формат:
- Item-specific license agreed upon to submission
- Опис: