Вивчення молекулярних механізмів противірусної активності флавоноїдів
| dc.contributor.advisor | Галкін, Олександр Юрійович | |
| dc.contributor.advisor | Рибалко, Світлана Леонтіївна | |
| dc.contributor.author | Архипова, Марина Андріївна | |
| dc.date.accessioned | 2024-05-27T13:53:22Z | |
| dc.date.available | 2024-05-27T13:53:22Z | |
| dc.date.issued | 2024 | |
| dc.description.abstract | Архипова М.А. Вивчення молекулярних механізмів противірусної активності флавоноїдів. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 – Біологія. – Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського», Київ, 2024. У дисертаційній роботі представлені результати дослідження противірусних властивостей комплексного фітопрепарату та його активних фармакологічних інгредієнтів, встановлення механізмів його антивірусної дії. Однією з основних задач сучасної фармації є пошук нових лікарських препаратів на основі рослинних компонентів. Серед таких рослинних речовин флавоноїди є перспективним джерелом біологічно активних сполук з широким спектром дії, зокрема з противірусними властивостями. Молекулярні механізми їхньої противірусної дії, головним чином, полягають у блокуванні ферментів, що беруть участь у реплікації вірусів, таких як нейрамінідаза, протеаза і ДНК/РНКполімераза, а також у модифікації вірусних білків. Комбінування різних флавоноїдів або їх поєднання з синтетичними противірусними препаратами може збільшити їхню ефективність в боротьбі з вірусами. Стратегії доставки ліків, що базуються на флавоноїдах, значно покращують їхню біодоступність. Поява нових вірусних інфекцій з високою вірулентністю та пандемічним поширенням підкреслює необхідність розробки нових противірусних засобів, серед яких флавоноїдні речовини виявляються перспективними. Оцінка противірусної активності коктейлю флавоноїдів може бути корисною для профілактики вірусних інфекцій та покращення сучасної противірусної терапії. Одним з таких комплексних лікарських препаратів рослинного походження є фітопрепарат на основі лікарських рослин Filipendula vulgaris, Petroselinum crispum, Apium graveolens, Galium verum, Linaria vulgaris, Calendula officinalis. Слід зазначити, що лікарські рослини, що складають основу фітопрепарату, містять низку біологічно активних речовин флавоноїдної природи. Тому актуальним є проведення дослідження антивірусної активності та молекулярних механізмів противірусної активності фітопрепарату та його активних фармацевтичних інгредієнтів. Перший розділ дисертаційної роботи «Огляд літератури» включає аналіз ролі флавоноїдів в інгібуванні репродукції вірусів, механізмів дії активних флавоноїдних інгредієнтів та їх клінічного значення, а також розгляд потенційних мішеней антивірусної дії рецептору епідермального фактору росту HER-2 та транскрипційного фактору Nrf2. У другому розділі «Матеріали та методи» описані використані матеріали, середовища, реактиви, культури клітин, віруси та тест-системи. Подано методи, використані у дослідженні, такі як визначення концентрації білку, культивування клітин, визначення цитотоксичної та ефективної концентрації препаратів, аналіз впливу на репродукцію вірусу, інтерфероногенну активність та експресію генів фактору транскрипції Nrf2 та епідермального фактору росту HER-2. У третьому розділі розглядається дослідження антивірусної активності фітопрепарату та його флавоноїдних компонентів на моделях герпетичної, коронавірусної інфекції, а також вірусу папіломи людини. Спиртовий розчин фітопрепарату є активним інгібітором реплікації вірусів простого герпесу 1 та 2 типів з індексом селективності 178 для ВПГ-1, 89 для ВПГ-2; 110 для та коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней, 320 для моделі вірусу гепатиту С та 31 для вірусу папіломи людини. Ефективні концентрації фітопрепарату у формі спиртового розчину (EC50) за концентрацією поліфенольних сполук становили: 0,31 мкг/мл для ВПГ-1 та вірусу гепатиту С; 0,63 мкг/мл для ВПГ-2 та коронавірусу ТГС; 62,5 мкг/мл для вірусу папіломи людини, що характеризує фітопрепарат у формі спиртового розчину як перспективний антивірусний препарат. Для фітопрепарату у формі екстракту та капсул значення індексу селективності дорівнювало 500 для вірусу простого герпесу 1 та 2 типів, при ефективній концентрації 0,125 мкг/мл, що характеризує його як активний антигерпетичний препарат. А на моделі коронавірусу ТГС індекс селективності становив 125 для екстракту, 250 для капсульної маси, при ефективній концентрації 0,63 мкг/мл. При дослідженні фітопрепарату у формі екстракту та капсул на моделі продукуючої вірус папіломи людини культурі клітин HeLa значення ефективної концентрації були 2 мкг/мл, індексу селективності – 31. Отримані результати вказують на більш активну антивірусну дію фітопрепарату у формі екстракту і капсул, ніж фітопрепарату у формі спиртового розчину. В результаті експериментальних досліджень доведено ефективність фітопрепарату в лікуванні генітального герпесу. На моделі генітального герпесу морських свинок показано, що фітопрепарат при комбінованому режимі (per os + аплікація) відстрочує появу перших симптомів і скорочує час перебігу захворювання. Індекс ефективності лікувальної дії фітопрепарату на рівні протигерпетичного препарату ацикловіру. У четвертому розділі «Механізми противірусної дії фітопрепарату та його активних флавоноїдних компонентів» доведено, що антивірусна активність препарату реалізується за рахунок молекулярних механізмів, таких як інгібування РНК- та ДНК-синтезу, індукції інтерферону, апоптозмоделюючої активності, інгібіції генів ВПГ-1 та коронавірусу ТГС, а також моделювання експресії генів Nrf2 та HER-2. Було встановлено інгібуючий вплив фітопрепарату на синтез РНК та ДНК. Для дослідження впливу на синтез РНК використовувалася модельна система транскрипції на основі ДНК-залежної РНК-полімерази фагу Т7 (РНКП Т7), яка є ефективною та зручною у використанні. В результаті експерименту було показано, що фітопрепарат блокує синтез РНК in vitro. За допомогою обраної для дослідження впливу фітопрепарату на синтез ДНК ПЛР-РЧ системи визначення експресії гена GAPDH з клітинної лінії К562, було встановлено, що фітопрепарат має інгібуючий вплив на експресію гена GAPDH, що свідчить про його здатність впливати на синтез ДНК. Доведено, що перспективний лікувальний противірусний потенціал досліджуваних форм фітопрепарату реалізується також через імуномодулюючий вплив шляхом індукції a-інтерферону. Встановлено, що інтерферон, індукований досліджуваним фітопрепаратом, можна класифікувати як a-інтерферон. Рівень індукції ендогенного a-інтерферону досліджуваним фітопрепаратом подібний до ефекту, який спричиняє референтний препарат поліінозинової-поліцитидилової кислоти. Показано, що у клітинах Jurkat, які були інфіковані вірусом простого герпесу 1 типу (ВПГ-1), спостерігалося значне збільшення апоптозу – на понад 30% у порівнянні з інтактною культурою клітин. Також відзначалося зниження вмісту клітин у фазі S та збільшення вмісту клітин у фазі G2/M. Використання фітопрепарату помітно знижувало вміст апоптотичних клітин, а також нормалізувало розподіл клітин за фазами клітинного циклу. У дослідженні впливу фітопрепарату на гени вірусу простого герпесу UL10, UL23, UL30, UL1, UL48 методом ПЛР, вперше було встановлено, що фітопрепарат, а також синтетичний флавоноїд апігенін, інгібували експресію гена UL10, який кодує глікопротеїн М, необхідний для реплікації вірусу в культурі клітин. Методом молекулярного докінгу показано, що флавоноїдні компоненти фітопрепарату, такі як кверцетин, лютеолін та апігенін, виявили здатність ефективно взаємодіяти з важливими компонентами вірусу SARS-CoV-2. Вони успішно утворювали комплекси з білково-нуклеїновим комплексом NSP16-NSP10-РНК, метилтрансферазою, основною протеазою та РНК-залежною РНКполімеразою. Аналіз взаємодії показав, що ці інгібітори блокують активність ферментів вірусу, завдяки розміщенню у важливих регуляторних кишенях або блокуванню каталітичної діади, що вказує на потенційну антивірусну активність досліджуваних інгібіторів проти SARS-CoV-2. За результатами дослідження вплив фітопрепарату у формі спиртового розчину та його активних флавоноїдних компонентів на експресію генів коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС) встановлено, що фітопрепарат та його активні компоненти – апігенін і тетраметоксикверцетин інгібують експресію генів ORF1a та ORF3b коронавірусу ТГС. Отримані результати свідчать про те, що механізм антивірусної дії фітопрепарату, як можливого антикоронавірусного агента, відбувається за рахунок інгібування генів і відкривають перспективи подальших досліджень у напрямку створення антикоронавірусного препарату. Результати молекулярного докінгу флавоноїдних компонентів фітопрепарату до сайтів зв'язування гелікази папіломавірусу людини вказують на потенційну можливість цих сполук впливати на репродукцію вірусу. Зокрема, тетраметоксикверцетин продемонстрував змінений зразок зв'язування до гелікази папіломавірусу, відмінний від кверцетину та інших аналогів. Це свідчить про те, що тетраметоксикверцетин може мати унікальну взаємодію з геліказою папіломавірусу, що може вплинути на його активність та можливості репродукції. У дослідженні впливу фітопрепарату на експресію гену транскрипційного фактору Nrf2 in vitro в клітинах Jurkat методом ПЛР було встановлено, що інфікування коронавірусом ТГС та ВПГ-1 призвело до незначного зменшення експресії гену транскрипційного фактору Nrf2, але у клітинах, оброблених фітопрепаратом та інфікованих вірусами ТГС та ВПГ-1 рівень експресії гену транскрипційного фактору Nrf2 збільшувався. Вплив фітопрепарату та синтетичних флавоноїдів на експресію гена рецептора епідермального фактора росту HER-2 у клітинах Jurkat, інфікованих клітин вірусом простого герпесу 1 типу призводив до збільшення рівня експресії ДНК рецептора епідермального фактора росту HER-2 та до зменшення рівня експресії мРНК рецептора епідермального фактора росту HER-2. Однак обробка клітин фітопрепаратом спричинила зменшення цього показника. Транскрипційний аналіз експресії гена рецептора епідермального фактора росту HER-2 після обробки клітин фітопрепаратом та синтетичними флавоноїдами показав, що інфікування клітин цим вірусом не суттєво впливає на рівень мРНК рецептора епідермального фактора росту HER-2. Обробка клітин фітопрепаратом та синтетичними флавоноїдами призвела до зменшення рівня мРНК рецептора епідермального фактора росту HER-2, особливо вираженого у випадку фітопрепарату. У п'ятому розділі було проведено аналіз та узагальнення результатів. Отримані та проаналізовані результати вказують на перспективність подальших досліджень фітопрепарату в якості протигерпетичного, протикоронавірусного та протипапіломавірусного препарату з полімішеневим механізмом антивірусної дії. | |
| dc.description.abstractother | Arkhypova M.A. Study of molecular mechanisms of antiviral activity of flavonoids. – Qualifying scientific work on manuscript rights. Dissertation for obtaining the scientific degree of Philosophy Doctor in specialty 091 – Biology. – National Technical University of Ukraine "Ihor Sikorsky Kyiv Polytechnic Institute", Kyiv, 2024. The dissertation presents the results of the study of the antiviral properties of the complex phytopreparation and its active pharmacological ingredients, establishing the mechanisms of its antiviral action. One of the main tasks of modern pharmacy is the search for new medicines based on plant components. Among such plant substances, flavonoids are a promising source of biologically active compounds with a wide spectrum of action, in particular with antiviral properties. The primary molecular mechanisms behind their antiviral effects primarily involve hindering enzymes crucial for virus replication, such as proteases, neuraminidase, RNA/DNA polymerases. Additionally, they contribute to altering various viral proteins. Combining different flavonoids or combining them with synthetic antiviral drugs can increase their effectiveness in fighting viruses. Drug delivery strategies based on flavonoids significantly improve their bioavailability. The emergence of new viral infections with high virulence and pandemic distribution emphasizes the need to develop new antiviral agents, among which flavonoid substances are promising. Evaluation of the antiviral activity of a cocktail of flavonoids may be useful for the prevention of viral infections and the improvement of current antiviral therapy. One of such complex medicinal preparations of plant origin is a phytopreparation based on medicinal plants Filipendula vulgaris, Petroselinum crispum, Apium graveolens, Galium verum, Linaria vulgaris, Calendula officinalis. It should be noted that the medicinal plants that make up the basis of the phytopreparation contain a number of biologically active substances of flavonoid nature. Therefore, it is relevant to conduct a study of the antiviral activity and molecular mechanisms of the antiviral activity of the phytopreparation and its active pharmaceutical ingredients. The first section of the dissertation, "Literature Review", includes an analysis of the role of flavonoids in inhibiting virus reproduction, the mechanisms of action of active flavonoid ingredients and their clinical significance, as well as consideration of the potential targets of antiviral activity of HER-2 and Nrf2. The second section, "Materials and Methods", describes the materials, media, reagents, cell cultures, viruses, and test systems used. The methods used in the study are presented, such as determination of protein concentration, cell cultivation, determination of cytotoxic and effective concentration of drugs, analysis of the effect on virus reproduction, interferonogenic activity and expression of transcription factor Nrf2 and epidermal growth factor receptor HER-2 genes. The third chapter examines the study of the antiviral activity of the phytopreparation and its flavonoid components on models of herpes, coronavirus infection, and human papilloma virus. The alcoholic solution of the phytopreparation is an active inhibitor of the replication of herpes simplex virus types 1 and 2 and TGS coronavirus with a selectivity index of 178 for HSV-1, 89 for HSV-2, 110 for TGS coronavirus, 320 for hepatitis C and 31 for human papillomavirus. The effective concentrations of the phytopreparation in the form of an alcoholic solution (EC50) according to the concentration of polyphenolic compounds were: 0.31 g/ml for HSV-1 and HCV; 0.63 g/ml for HSV-2 and TGS coronavirus, 62.5 g/ml for HPV, which characterizes the phytopreparation in the form of an alcoholic solution as promising an antiviral drug. For the phytopreparation in the form of extract and capsules, the value of the selectivity index was equal to 500 for herpes simplex virus types 1 and 2, at an effective concentration of 0.125 g/ml, which characterizes it as an active antiherpetic drug. And on the TGS coronavirus model, the selectivity index was 125 for the extract, 250 for the capsule mass, at an effective concentration of 0.63 g/ml. When studying the phytopreparation in the form of extract and capsules on the model of the human papilloma virus-producing HeLa cell culture, the values of the effective concentration were 2 g/ml, the selectivity index was 31. The obtained results indicate a more active antiviral effect of the phytopreparation in the form of extract and capsules than the phytopreparation in the form of alcohol solution. As a result of experimental studies, the effectiveness of the phytopreparation in the treatment of genital herpes has been proven. On the model of genital herpes of guinea pigs, it is shown that the phytopreparation in the combined mode (per os +application) delays the appearance of the first symptoms and shortens the course of the disease. The index of effectiveness of the medicinal effect of the phytopreparation is at the level of the antiherpetic drug acyclovir. In the fourth chapter "Mechanisms of the antiviral action of the phytopreparation and its active flavonoid components" it is proven that the antiviral activity of the drug is realized due to molecular mechanisms, such as inhibition of RNA and DNA synthesis, induction of interferon, apoptosis-modulating activity, inhibition of HSV-1 and TGE coronavirus genes, as well as modeling of Nrf2 and HER-2 gene expression. The inhibitory effect of the phytopreparation on the synthesis of RNA and DNA was established. To study the effect on RNA synthesis, a model transcription system based on phage DNA-dependent RNA polymerase T7 (T7 RNAP), which is efficient and convenient to use, was used. As a result of the experiment, it was shown that the phytopreparation blocks the synthesis of RNA in vitro. Using the PCR-RТ system for determining the expression of the GAPDH gene from the K562 cell line, chosen for the study of the effect of the phytopreparation on DNA synthesis, it was established that the phytopreparation has an inhibitory effect on the expression of the GAPDH gene, which indicates its ability to influence DNA synthesis. It has been proven that the promising therapeutic antiviral potential of the investigated forms of the phytopreparation is realized also through the immunomodulatory effect by induction of a-interferon. It was established that the interferon induced by the investigated phytopreparation can be classified as ainterferon. The level of induction of endogenous a-interferon by the investigated phytopreparation is similar to the effect caused by the reference drug Poly(I)-Poly(C). It was shown that in Jurkat cells that were infected with herpes simplex virus type 1 (HSV-1), a significant increase in apoptosis was observed - by more than 30% compared to intact cell culture. A decrease in the content of cells in the S phase and an increase in the content of cells in the G2/M phase were also noted. The use of phytopreparation markedly reduced the content of apoptotic cells, and also normalized the distribution of cells according to the phases of the cell cycle. In the study of the effect of the phytopreparation on the genes of the herpes simplex virus UL10, UL23, UL30, UL1, UL48, it was established for the first time by the PCR method that the phytopreparation, as well as the synthetic flavonoid apigenin, inhibited the expression of the UL10 gene, which encodes glycoprotein M, which is necessary for virus replication in culture cells The method of molecular docking showed that the flavonoid components of the phytopreparation, such as quercetin, luteolin and apigenin, showed the ability to effectively interact with important components of the SARS-CoV-2 virus. They successfully formed complexes with the NSP16-NSP10-RNA protein-nucleic complex, methyltransferase, basic protease and RNA-dependent RNA polymerase. Interaction analysis showed that these inhibitors block the activity of viral enzymes, due to placement in important regulatory pockets or blocking the catalytic dyad, indicating the potential antiviral activity of the investigated inhibitors against SARSCoV-2. According to the results of the study of the effect of the phytopreparation in the form of an alcohol solution and its active flavonoid components on the expression of the genes of the swine transmissible gastroenteritis (TGE) coronavirus, it was established that the phytopreparation and its active components - apigenin and tetramethoxyquercetin inhibit the expression of the ORF1a and ORF3b genes of the swine TGE coronavirus. The obtained results indicate that the mechanism of antiviral action of the phytopreparation, as a possible anti-coronavirus agent, occurs due to gene inhibition and open the prospects for further research in the direction of creating an anti-coronavirus drug. The results of molecular docking of the flavonoid components of the phytopreparation to the human papillomavirus helicase binding sites indicate the potential of these compounds to influence virus reproduction. In particular, tetramethoxyquercetin demonstrated an altered binding pattern to papillomavirus helicase, different from quercetin and other analogues. This suggests that tetramethoxyquercetin may have a unique interaction with the papillomavirus helicase that may affect its activity and reproductive capabilities. In the study of the effect of the phytopreparation on the expression of the Nrf2 transcription factor gene in vitro in Jurkat cells by PCR, it was established that infection with the TGE coronavirus and HSV-1 led to a slight decrease in the expression of the Nrf2 transcription factor gene, but in cells treated with the phytopreparation and infected with the TGE and HSV-1 viruses gene expression level of transcription factor Nrf2 increased. The effect of the phytopreparation and synthetic flavonoids on the expression of the epidermal growth factor receptor HER-2 gene in Jurkat cells infected with herpes simplex virus type 1 led to an increase in the expression level of HER-2 epidermal growth factor receptor DNA and a decrease in the expression level of mRNA HER-2 epidermal growth factor receptor. However, treatment of cells with a phytopreparation caused a decrease in this indicator. Transcriptional analysis of the expression of the epidermal growth factor receptor HER-2 gene after treatment of cells with a phytopreparation and synthetic flavonoids showed that infection of cells with this virus does not significantly affect the mRNA level of the epidermal growth factor receptor HER-2. Treatment of cells with a phytopreparation and synthetic flavonoids led to a decrease in the mRNA level of the epidermal growth factor receptor HER-2, which was especially pronounced in the case of the phytopreparation. In the fifth chapter, the analysis and generalization of the results is carried out. The obtained and analyzed results indicate the prospects of further research of the phytopreparation as an anti-herpetic, anti-coronavirus and anti-papilloma virus drug with a multi-target mechanism of antiviral action. | |
| dc.format.extent | 174 с. | |
| dc.identifier.citation | Архипова, М. А. Вивчення молекулярних механізмів противірусної активності флавоноїдів : дис. … д-ра філософії : 091 – Біологія / Архипова Марина Андріївна. – Київ, 2024. – 174 с. | |
| dc.identifier.uri | https://ela.kpi.ua/handle/123456789/66915 | |
| dc.language.iso | uk | |
| dc.publisher | КПІ ім. Ігоря Сікорського | |
| dc.publisher.place | Київ | |
| dc.subject | флавоноїди | |
| dc.subject | фітопрепарат | |
| dc.subject | вірус простого герпесу 1 типу | |
| dc.subject | вірус простого герпесу 2 типу | |
| dc.subject | коронавірус ТГС | |
| dc.subject | модель вірусу гепатиту С | |
| dc.subject | папіломавірус людини | |
| dc.subject | антивірусна активність in vitro | |
| dc.subject | інтерфероногенна дія | |
| dc.subject | апоптозмодулюючий вплив | |
| dc.subject | дослідження in vivo | |
| dc.subject | молекулярний докінг in silico | |
| dc.subject | транскрипційний фактор Nrf2 | |
| dc.subject | рецептор епідермального фактора росту HER-2 | |
| dc.subject | flavonoids | |
| dc.subject | phytopreparation | |
| dc.subject | herpes simplex virus type 1 | |
| dc.subject | herpes simplex virus type 2 | |
| dc.subject | TGE coronavirus | |
| dc.subject | hepatitis C virus model | |
| dc.subject | human papillomavirus | |
| dc.subject | antiviral activity in vitro | |
| dc.subject | interferonogenic effect | |
| dc.subject | apoptosis-modulating effect | |
| dc.subject | in vivo research | |
| dc.subject | molecular docking in silico | |
| dc.subject | transcription factor Nrf2 | |
| dc.subject | epidermal growth factor receptor HER-2 | |
| dc.subject.udc | [615.281.8:615.322].015:577.2](043.3) | |
| dc.title | Вивчення молекулярних механізмів противірусної активності флавоноїдів | |
| dc.type | Thesis Doctoral |
Файли
Контейнер файлів
1 - 1 з 1
Вантажиться...
- Назва:
- Arkhypova_dys.pdf
- Розмір:
- 3.38 MB
- Формат:
- Adobe Portable Document Format
Ліцензійна угода
1 - 1 з 1
Ескіз недоступний
- Назва:
- license.txt
- Розмір:
- 8.98 KB
- Формат:
- Item-specific license agreed upon to submission
- Опис: