Біотехнологія отримання та низькотемпературного зберігання похідних плаценти для лікування гінекологічної патології
Вантажиться...
Дата
2025
Автори
Науковий керівник
Назва журналу
Номер ISSN
Назва тому
Видавець
Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України
Анотація
Прокопюк В.Ю. Біотехнологія отримання та низькотемпературного зберігання похідних плаценти для лікування гінекологічної патології. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – «Біотехнологія». Дисертація виконана в Інституті проблем кріобіології та кріомедицини НАН України, Харків. Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського» МОН України, Київ, 2025.
Швидкий розвиток клітинної та тканинної терапії робить актуальним пошук нових біотехнологій отримання та зберігання біопрепаратів.
Перспективним джерелом клітин, тканин, та біологічно активних речовин для клінічного застосування є плацента. Це обумовлено різноманіттям клітин та тканин, які можна отримати, великим проліферативним потенціалом, низькою імуногенністю, відсутністю етичних проблем, можливістю застосування аутоматеріалу. Для успішного застосування похідних плаценти необхідно створення ефективних біотехнологій отримання, довгострокового зберігання та транспортування, що може бути забезпечене завдяки застосуванню низьких температур. Важливою особливістю похідних плаценти є їх тропність до органів жіночої статевої системи. Під час вагітності під дією плаценти змінюється функціонування ряду систем організму матері та перебіг багатьох захворювань, що створює підґрунтя до їх застосування насамперед при патології жіночої статевої системи. Гінекологічними захворюваннями, що вносять вагомий вклад в захворюваність та можуть бути успішно проліковані кріоконсервованими похідними плаценти є: інфекційна, аутоімунна, ендокринна патологія, ішемічні та післяопераційні порушення. За даними U.S. National Library of Medicine та U.S. National Institutes of Health зареєстровано близько 16000 досліджень та 400 клінічних випробувань, присвячених похідним плаценти. Втім невирішеним залишається ряд питань. В Україні плацента та виділені з неї клітини відносяться до «Переліку тканин і клітин людини, з якими дозволена діяльність банків пуповинної крові, інших тканин і клітин людини» (Наказ МОЗ № 276 від 20.04.2012, зареєстровано в Міністерстві юстиції України 5.07.2012 за № 1124/21436) та не поширюється на сферу дії закону «Про застосування трансплантації анатомічних матеріалів людині» (ст. 3., редакція № 1967-IX від 16.12.2021). Таким чином, виготовлення застосування препаратів плаценти не вважається трансплантацією та може бути реалізовано банками пуповинної крові, інших тканин і клітин людини. Розроблені технології отримання, кріоконсервування експлантів плаценти, клітин, тканинноінженерних структур потребують вдосконалення з метою підвищення збереженості матеріалу, для чого необхідно з'ясувати особливості впливу різних факторів кріоконсервування та компонентів середовища на біооб’єкти. Нез’ясованими є також характер впливу плаценти та її похідних на статеву систему, перебіг ряду захворювань, та можливість їхнього застосування в лікуванні патологічних процесів. Невирішеними є практичні задачі кріоконсервування тканин, біоінженерних структур, довгострокового зберігання та транспортування біоматеріалу, вдосконалення існуючих методів кріоконсервування, оскільки вони не завжди забезпечують повне збереження матеріалу. Існуючи методи лікування гінекологічної патології не забезпечують достатньої ефективності, тому потребують вдосконалення та пошуку нових шляхів подолання проблеми. Метою дослідження було наукове обґрунтування біотехнології отримання та зберігання похідних плаценти для лікування гінекологічної патології. Робота має три розділи. На першому визначали можливості отримання, вплив факторів кріоконсервування, гіпотермічного, субнормотермічного зберігання на похідні плаценти (клітини, експланти, сфероїди, альгінатні носії). На другому виявляли вплив кріоконсервованих похідних плаценти на окремі культури клітин та тканин в системі in vitro (фібробласти, нейроклітини, спленоцити, матка, яєчники). На третьому вивчали вплив кріоконсервованих похідних плаценти на функції жіночої статевої системи в нормі та при моделюванні типових патологічних станів (інфекційний процес, антифосфоліпідний синдром, полікистоз яєчників, травма та ішемія яєчників, операційна травма, постхіміотерапевтичне передчасне виснаження яєчників). Для отримання та характеристики похідних плаценти застосовувались методи культивування клітин, тканин, створення тканинноінженерних структур, світлову, конфокальну лазерну скануючи мікроскопію, проточну цитометрію, біохімічні методи. Для оцінки впливу факторів кріоконсервування застосовували програмне заморожування, кріомікроскопію, методи повільного та швидкого заморожування. Для оцінки впливу похідних плаценти на жіночу репродуктивну систему застосовували моделювання патологічних станів на лабораторних тваринах, гістологічні, морфометричні біохімічні методи. Використовували комп’ютерну обробку зображань, даних конфокальної мікроскопії, проточної цитометрії, статистичну обробку даних. У дисертаційній роботі вперше проведено комплексне теоретичне обґрунтування біотехнологічних підходів до отримання, кріоконсервування, гіпотермічного зберігання похідних плаценти (експлантів, клітин в суспензії, в сфероїдах та інкапсульованих в альгінатних сферах) та їх застосування при найбільш розповсюдженій та соціально значущої гінекологічній патології в експерименті. Встановлено, що експланти, клітини плаценти в суспензії та в альгінатних мікросферах зберігають структуру, життєздатність та метаболічні характеристики (за даними вітального забарвлення, тестів МТТ та відновлення резазурину) при культивуванні. Сфероїди, отримані з клітин плаценти є нестійкими, мають тенденцію до руйнування та адгезії. Клітини, виділені з ворсин плаценти, плідних оболонок мають характеристики мезенхімальних стовбурових клітин (імунофенотип CD90+, CD73+, CD105+, CD34-, здатні до індукованого диференціювання в адипогенному, хондрогенному та остеогенному напрямку). Вперше виявлено, що при субнормотермічних умовах (20ºС) експланти, клітини плаценти в суспензії та в альгінатних мікросферах зберігають структуру, життєздатність та метаболічні характеристики 48 годин, сфероїди - 24 години. При зниженні температури до гіпотермічних умов (4ºС) термін збереження знижується до 24 годин для всіх похідних плаценти. Кріоконсервування під захистом 10% диметилсульфоксиду та охолодженням зі швидкістю 1°С/хв до -80°С з наступним зануренням у рідкий азот дозволяє отримати збереженість клітин та експлантів плаценти більш 90% за показниками структурної цілісності та життєздатності, клітин в альгінатних сферах – близько 70%, сфероїдів – близько 50% зі значним руйнуванням. Вперше встановлено, що типовими кріоушкодженями для експлантів плаценти є розриви сполучної тканини та десквамація трофобласту внаслідок росту кристалів. Для сфероїдів з клітин плаценти характерне пошкодження кристалами міжклітинних зав’язків та загибель клітин по периферії сфероїдів. В альгінатних гранулах з клітинами плаценти при кріоконсервуванні утворюються зони з великими кристалами (до 150 мкм), та зони з невеликими кристалами (до 3 мкм), що є результатом взаємодії кріопротектора з альгінатом. Максимальна збереженість клітин плаценти на рівні більше 80% спостерігається при застосуванні у якості кріопротекторів диметилсульфоксиду, пропандіолу, етиленгліколю. При застосуванні сахарози, гліцерину життєздатність клітин не перевищує 70%. Заміна середовища DMEM сольовими розчинами NaCl, Рінгеру чи Хенксу зменшує кількість життєздатних клітин після кріоконсервування. Наявність сироватки не впливає на кріозахисні властивості середовищ. Вперше доведено, що для ефективного кріоконсервування клітин плаценти необхідно проводити охолодження зі швидкістю 1ºС/хв до -40ºС, або нижче, з наступним зануренням у рідкий азот. Повторне заморожування клітин плаценти без рекультивування призводить до втрати близько 50% клітин. При коливанні температур в кріосховищі в межах -196ºС… - 100ºС до 20 разів збереженість клітин плаценти залишається незмінною. При більшій кількості коливань, або коливаннях температури до -80ºС кількість клітин, їх життєздатність, метаболічні характеристики знижуються, водночас збільшується кількість апоптотично змінених клітин. Вперше в системі in vitro продемонстровано, що середовища, кондиційовані клітинами та експлантами плаценти підвищують метаболічну активність нейроклітин, органотипових культур матки, пригнічують її в культурах яєчниках, спленоцитів та не впливають на метаболічну активність фібробластів. Встановлено, що середовища, кондиційовані кріоконсервованими похідними плаценти вірогідно більше пригнічують метаболічну активність спленоцитів, ніж свіжовиділеними та чинять однаковий вплив на метаболічну активність та морфологічні характеристики нейроклітин, фібробластів, органотипових культур матки та яєчників. Вперше проведено комплексний аналіз впливу кріоконсервованих похідних плаценти на перебіг експериментальної гінекологічної патології. Імплантація кріоконсервованих експлантів плаценти здоровим експериментальним тваринам призводить до гіпертрофії яєчників, матки, затримки овуляції та часу настання вагітності, не впливає на репродуктивні показники. Показано, що імплантація кріоконсервованих експлантів плаценти при несанованому інфекційному процесі, знижує кількість тварин, що завагітніли з 80 до 40% та середню кількість плодів через підвищене спайкоутворення та активацію гострого запального процесу. Виявлено, що імплантація кріоконсервованих експлантів плаценти при експериментальному антифосфоліпідному синдромі дозволяє знизити активність лімфоцитів та швидкість згортання крові, підвищити кількість плодів. В моделі синдрому полікістозних яєчників застосування кріоконсервованих експлантів плаценти дозволяє відновити естральний цикл у 90% тварин, підвищити відсоток вагітних тварин з 0 до 40%. У моделі передчасного виснаження яєчників після хіміотерапії застосування кріоконсервованих експлантів плаценти відновлює естральний цикл, статеву функція, структуру матки, але не фертильність. У моделі ішемічного ураження яєчників після застосування кріоконсервованих експлантів плаценти значуще відновлюється кількість жовтих тіл та підвищується кількість плодів. Розроблено біотехнології кріоконсервування та гіпотермічного зберігання тканин та тканинно-інженерних структур. Для короткочасного зберігання похідних плаценти протягом 24-48 годин, яке частіше необхідне для транспортування доцільно застосовувати субнормотермічні умови – близько 20ºС та середовище культивування у концентрації 1×105 клітин/мл, чи 10 мл на 1 г експлантів. Виявлено, що найбільш прийнятними формами похідних плаценти для застосування є кріоконсервовані клітини та експланти. Запропоновано біотехнологічні підходи кріоконсервування та короткочасного гіпотермічного зберігання похідних плаценти, що базуються на основі дозволених до застосування в клінічній практиці речовин (пропандіол, розчин Рінгеру, 0,9% NaCl) та обладнання, які є на устаткуванні більшості лікарень (холодильне обладнання). Запропоновані методи швидкої оцінки вихідного стану та збереженості після кріоконсервування, гіпотермічного зберігання експлантів, сфероїдів з плаценти, які можуть бути застосовані для інших тканин, багатоклітинних комплексів. Ці методи є перспективними для використання у практиці низькотемпературних банків клітин, тканин та органів. Визначені особливості кріоушкодження різних багатоклітинних структур дають змогу вдосконалювати методи кріоконсервування тканин, багатоклітинних конструкцій та створювати нові тканинноінженерні конструкції більш резистентні до кріовпливу. Визначені перспективні напрямки дослідження, доцільність, можливі протипоказання, побічні дії до застосування похідних плаценти при патології жіночої репродуктивної системи. Показанням до застосування похідних плаценти при патології жіночої статевої системи можуть бути функційні ендокринні розлади (яєчникова недостатність, синдром полікістозних яєчників), аутоімунна патологія (антифосфоліпідний синдром), ішемічні явища (перекрут). Протипоказанням до призначення похідних плаценти при патології жіночої статевої системи є наявність несанованої інфекційної патології. При застосуванні похідних плаценти інтраопераційно доцільним є проведення протиспайкової профілактики у вигляді бар’єрних гелів.
Опис
Ключові слова
плацента, біотехнологія, кріоконсервування, низькотемпературне зберігання, регенеративна медицина, стовбурові клітини, клітинні культури, гінекологія, placenta, biotechnology, cryopreservation, low-temperature storage, regenerative medicine, stem cells, cell cultures, gynecology
Бібліографічний опис
Прокопюк, В. Ю. Біотехнологія отримання та низькотемпературного зберігання похідних плаценти для лікування гінекологічної патології : дис. … д-ра біол. наук : 03.00.20 - біотехнологія / Прокопюк Володимир Юрійович. – Харків, 2025. – 325 с.