Біотехнологія отримання та низькотемпературного зберігання похідних плаценти для лікування гінекологічної патології

Скорочена інформація про документ
dc.contributor.authorПрокопюк, Володимир Юрійович
dc.date.accessioned2025-04-02T12:09:05Z
dc.date.available2025-04-02T12:09:05Z
dc.date.issued2025
dc.description.abstractПрокопюк В.Ю. Біотехнологія отримання та низькотемпературного зберігання похідних плаценти для лікування гінекологічної патології. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – «Біотехнологія». Дисертація виконана в Інституті проблем кріобіології та кріомедицини НАН України, Харків. Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського» МОН України, Київ, 2025. Швидкий розвиток клітинної та тканинної терапії робить актуальним пошук нових біотехнологій отримання та зберігання біопрепаратів. Перспективним джерелом клітин, тканин, та біологічно активних речовин для клінічного застосування є плацента. Це обумовлено різноманіттям клітин та тканин, які можна отримати, великим проліферативним потенціалом, низькою імуногенністю, відсутністю етичних проблем, можливістю застосування аутоматеріалу. Для успішного застосування похідних плаценти необхідно створення ефективних біотехнологій отримання, довгострокового зберігання та транспортування, що може бути забезпечене завдяки застосуванню низьких температур. Важливою особливістю похідних плаценти є їх тропність до органів жіночої статевої системи. Під час вагітності під дією плаценти змінюється функціонування ряду систем організму матері та перебіг багатьох захворювань, що створює підґрунтя до їх застосування насамперед при патології жіночої статевої системи. Гінекологічними захворюваннями, що вносять вагомий вклад в захворюваність та можуть бути успішно проліковані кріоконсервованими похідними плаценти є: інфекційна, аутоімунна, ендокринна патологія, ішемічні та післяопераційні порушення. За даними U.S. National Library of Medicine та U.S. National Institutes of Health зареєстровано близько 16000 досліджень та 400 клінічних випробувань, присвячених похідним плаценти. Втім невирішеним залишається ряд питань. В Україні плацента та виділені з неї клітини відносяться до «Переліку тканин і клітин людини, з якими дозволена діяльність банків пуповинної крові, інших тканин і клітин людини» (Наказ МОЗ № 276 від 20.04.2012, зареєстровано в Міністерстві юстиції України 5.07.2012 за № 1124/21436) та не поширюється на сферу дії закону «Про застосування трансплантації анатомічних матеріалів людині» (ст. 3., редакція № 1967-IX від 16.12.2021). Таким чином, виготовлення застосування препаратів плаценти не вважається трансплантацією та може бути реалізовано банками пуповинної крові, інших тканин і клітин людини. Розроблені технології отримання, кріоконсервування експлантів плаценти, клітин, тканинноінженерних структур потребують вдосконалення з метою підвищення збереженості матеріалу, для чого необхідно з'ясувати особливості впливу різних факторів кріоконсервування та компонентів середовища на біооб’єкти. Нез’ясованими є також характер впливу плаценти та її похідних на статеву систему, перебіг ряду захворювань, та можливість їхнього застосування в лікуванні патологічних процесів. Невирішеними є практичні задачі кріоконсервування тканин, біоінженерних структур, довгострокового зберігання та транспортування біоматеріалу, вдосконалення існуючих методів кріоконсервування, оскільки вони не завжди забезпечують повне збереження матеріалу. Існуючи методи лікування гінекологічної патології не забезпечують достатньої ефективності, тому потребують вдосконалення та пошуку нових шляхів подолання проблеми. Метою дослідження було наукове обґрунтування біотехнології отримання та зберігання похідних плаценти для лікування гінекологічної патології. Робота має три розділи. На першому визначали можливості отримання, вплив факторів кріоконсервування, гіпотермічного, субнормотермічного зберігання на похідні плаценти (клітини, експланти, сфероїди, альгінатні носії). На другому виявляли вплив кріоконсервованих похідних плаценти на окремі культури клітин та тканин в системі in vitro (фібробласти, нейроклітини, спленоцити, матка, яєчники). На третьому вивчали вплив кріоконсервованих похідних плаценти на функції жіночої статевої системи в нормі та при моделюванні типових патологічних станів (інфекційний процес, антифосфоліпідний синдром, полікистоз яєчників, травма та ішемія яєчників, операційна травма, постхіміотерапевтичне передчасне виснаження яєчників). Для отримання та характеристики похідних плаценти застосовувались методи культивування клітин, тканин, створення тканинноінженерних структур, світлову, конфокальну лазерну скануючи мікроскопію, проточну цитометрію, біохімічні методи. Для оцінки впливу факторів кріоконсервування застосовували програмне заморожування, кріомікроскопію, методи повільного та швидкого заморожування. Для оцінки впливу похідних плаценти на жіночу репродуктивну систему застосовували моделювання патологічних станів на лабораторних тваринах, гістологічні, морфометричні біохімічні методи. Використовували комп’ютерну обробку зображань, даних конфокальної мікроскопії, проточної цитометрії, статистичну обробку даних. У дисертаційній роботі вперше проведено комплексне теоретичне обґрунтування біотехнологічних підходів до отримання, кріоконсервування, гіпотермічного зберігання похідних плаценти (експлантів, клітин в суспензії, в сфероїдах та інкапсульованих в альгінатних сферах) та їх застосування при найбільш розповсюдженій та соціально значущої гінекологічній патології в експерименті. Встановлено, що експланти, клітини плаценти в суспензії та в альгінатних мікросферах зберігають структуру, життєздатність та метаболічні характеристики (за даними вітального забарвлення, тестів МТТ та відновлення резазурину) при культивуванні. Сфероїди, отримані з клітин плаценти є нестійкими, мають тенденцію до руйнування та адгезії. Клітини, виділені з ворсин плаценти, плідних оболонок мають характеристики мезенхімальних стовбурових клітин (імунофенотип CD90+, CD73+, CD105+, CD34-, здатні до індукованого диференціювання в адипогенному, хондрогенному та остеогенному напрямку). Вперше виявлено, що при субнормотермічних умовах (20ºС) експланти, клітини плаценти в суспензії та в альгінатних мікросферах зберігають структуру, життєздатність та метаболічні характеристики 48 годин, сфероїди - 24 години. При зниженні температури до гіпотермічних умов (4ºС) термін збереження знижується до 24 годин для всіх похідних плаценти. Кріоконсервування під захистом 10% диметилсульфоксиду та охолодженням зі швидкістю 1°С/хв до -80°С з наступним зануренням у рідкий азот дозволяє отримати збереженість клітин та експлантів плаценти більш 90% за показниками структурної цілісності та життєздатності, клітин в альгінатних сферах – близько 70%, сфероїдів – близько 50% зі значним руйнуванням. Вперше встановлено, що типовими кріоушкодженями для експлантів плаценти є розриви сполучної тканини та десквамація трофобласту внаслідок росту кристалів. Для сфероїдів з клітин плаценти характерне пошкодження кристалами міжклітинних зав’язків та загибель клітин по периферії сфероїдів. В альгінатних гранулах з клітинами плаценти при кріоконсервуванні утворюються зони з великими кристалами (до 150 мкм), та зони з невеликими кристалами (до 3 мкм), що є результатом взаємодії кріопротектора з альгінатом. Максимальна збереженість клітин плаценти на рівні більше 80% спостерігається при застосуванні у якості кріопротекторів диметилсульфоксиду, пропандіолу, етиленгліколю. При застосуванні сахарози, гліцерину життєздатність клітин не перевищує 70%. Заміна середовища DMEM сольовими розчинами NaCl, Рінгеру чи Хенксу зменшує кількість життєздатних клітин після кріоконсервування. Наявність сироватки не впливає на кріозахисні властивості середовищ. Вперше доведено, що для ефективного кріоконсервування клітин плаценти необхідно проводити охолодження зі швидкістю 1ºС/хв до -40ºС, або нижче, з наступним зануренням у рідкий азот. Повторне заморожування клітин плаценти без рекультивування призводить до втрати близько 50% клітин. При коливанні температур в кріосховищі в межах -196ºС… - 100ºС до 20 разів збереженість клітин плаценти залишається незмінною. При більшій кількості коливань, або коливаннях температури до -80ºС кількість клітин, їх життєздатність, метаболічні характеристики знижуються, водночас збільшується кількість апоптотично змінених клітин. Вперше в системі in vitro продемонстровано, що середовища, кондиційовані клітинами та експлантами плаценти підвищують метаболічну активність нейроклітин, органотипових культур матки, пригнічують її в культурах яєчниках, спленоцитів та не впливають на метаболічну активність фібробластів. Встановлено, що середовища, кондиційовані кріоконсервованими похідними плаценти вірогідно більше пригнічують метаболічну активність спленоцитів, ніж свіжовиділеними та чинять однаковий вплив на метаболічну активність та морфологічні характеристики нейроклітин, фібробластів, органотипових культур матки та яєчників. Вперше проведено комплексний аналіз впливу кріоконсервованих похідних плаценти на перебіг експериментальної гінекологічної патології. Імплантація кріоконсервованих експлантів плаценти здоровим експериментальним тваринам призводить до гіпертрофії яєчників, матки, затримки овуляції та часу настання вагітності, не впливає на репродуктивні показники. Показано, що імплантація кріоконсервованих експлантів плаценти при несанованому інфекційному процесі, знижує кількість тварин, що завагітніли з 80 до 40% та середню кількість плодів через підвищене спайкоутворення та активацію гострого запального процесу. Виявлено, що імплантація кріоконсервованих експлантів плаценти при експериментальному антифосфоліпідному синдромі дозволяє знизити активність лімфоцитів та швидкість згортання крові, підвищити кількість плодів. В моделі синдрому полікістозних яєчників застосування кріоконсервованих експлантів плаценти дозволяє відновити естральний цикл у 90% тварин, підвищити відсоток вагітних тварин з 0 до 40%. У моделі передчасного виснаження яєчників після хіміотерапії застосування кріоконсервованих експлантів плаценти відновлює естральний цикл, статеву функція, структуру матки, але не фертильність. У моделі ішемічного ураження яєчників після застосування кріоконсервованих експлантів плаценти значуще відновлюється кількість жовтих тіл та підвищується кількість плодів. Розроблено біотехнології кріоконсервування та гіпотермічного зберігання тканин та тканинно-інженерних структур. Для короткочасного зберігання похідних плаценти протягом 24-48 годин, яке частіше необхідне для транспортування доцільно застосовувати субнормотермічні умови – близько 20ºС та середовище культивування у концентрації 1×105 клітин/мл, чи 10 мл на 1 г експлантів. Виявлено, що найбільш прийнятними формами похідних плаценти для застосування є кріоконсервовані клітини та експланти. Запропоновано біотехнологічні підходи кріоконсервування та короткочасного гіпотермічного зберігання похідних плаценти, що базуються на основі дозволених до застосування в клінічній практиці речовин (пропандіол, розчин Рінгеру, 0,9% NaCl) та обладнання, які є на устаткуванні більшості лікарень (холодильне обладнання). Запропоновані методи швидкої оцінки вихідного стану та збереженості після кріоконсервування, гіпотермічного зберігання експлантів, сфероїдів з плаценти, які можуть бути застосовані для інших тканин, багатоклітинних комплексів. Ці методи є перспективними для використання у практиці низькотемпературних банків клітин, тканин та органів. Визначені особливості кріоушкодження різних багатоклітинних структур дають змогу вдосконалювати методи кріоконсервування тканин, багатоклітинних конструкцій та створювати нові тканинноінженерні конструкції більш резистентні до кріовпливу. Визначені перспективні напрямки дослідження, доцільність, можливі протипоказання, побічні дії до застосування похідних плаценти при патології жіночої репродуктивної системи. Показанням до застосування похідних плаценти при патології жіночої статевої системи можуть бути функційні ендокринні розлади (яєчникова недостатність, синдром полікістозних яєчників), аутоімунна патологія (антифосфоліпідний синдром), ішемічні явища (перекрут). Протипоказанням до призначення похідних плаценти при патології жіночої статевої системи є наявність несанованої інфекційної патології. При застосуванні похідних плаценти інтраопераційно доцільним є проведення протиспайкової профілактики у вигляді бар’єрних гелів.
dc.description.abstractotherProkopiuk V.Yu. Biotechnology of obtaining and low-temperature storage of placental derivatives for the treatment of gynecological pathology. - The qualifying scientific paper as a manuscript. Dissertation for the doctor of bioligical science degree in specialty 03.00.20 - “Biotechnology”. Completed in the Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkіv. National Technical University of Ukraine «Igor Sikorsky Kyiv Polytechnic Institute», Ministry of Education and Science of Ukraine. Kyiv, 2025. The rapid development of cell and tissue therapy makes the search for new biotechnologies for obtaining and storing biological preparations urgent. Placenta is a perspective source of cells, tissues, and biologically active substances for clinical application. This is stipulated by the variety of the cells and tissues that can be obtained, high proliferative potential, low immunogenicity, lack of ethical issues, and the possibility of autobanking. For the successful application of placental derivatives, it is necessary to create the effective obtaining, long-term storage and transport biotechnologies, that can be achieved using low temperatures. An important feature of the placental derivatives is their tropism to the female reproductive system. During pregnancy under the placental influence, the functioning of a number of systems of the mother's body and the course of many diseases change, that creates the basis for their application when treating the female reproductive system pathology. Gynecological pathologies such as infectious, autoimmune, endocrine ones, ischemic and post-surgery disorders, contributing greatly in morbidity, can be successfully treated with the cryopreserved placental derivatives. According to the data of U.S. National Library of Medicine and U.S. The National Institutes of Health there were documented around 16,000 studies and 400 clinical trials with using the placental derivatives. However, a number of issues has remained unsolved. In Ukraine, the placenta and the cells isolated from it belong to the "List of human tissues and cells with which the activity of umbilical cord blood banks, other human tissues and cells is allowed" (Order of the Ministry of Health No. 276 of 04/20/2012, registered in the Ministry of Justice of Ukraine on 07/05/2012 No. 1124/21436) and does not apply to the scope of the law "On the application of transplantation of anatomical materials to humans" (Article 3., revision No. 1967-IX dated 16.12.2021). Thus, the manufacture of placenta preparations is not considered transplantation and can be implemented by banks of umbilical cord blood, other human tissues and cells. The biotechnologies of obtaining and storage of placental explants, cells, tissue engineered structures need to be improve, wherefore it is necessary to reveal the mechanisms of an influence of various cryopreservation factors and media components on biological objects. The mechanism of placenta and its derivatives influence on woman`s body, changes in the course of a number of diseases during pregnancy, and the possibility of their application to treat the pathological processes have been also uncovered. Problems of cryopreservation of tissues, bioengineered structures, long-term storage and transport of biomaterials, as well as the improvement of existing cryopreservation methods have not been solved since they do not always provide a complete preservation of the material. Existing methods of gynecological and obstetric pathology treatment do not provide 100% effectiveness; therefore, they need to be improved and the new ways to overcome the problem have to be found. The aim of the study was scientific substantiation of the biotechnology of obtaining and storing placenta derivatives for the treatment of gynecological pathology. The work consists of three parts. In the first, the possibilities of obtaining, influence of cryopreservation, hypothermic subnormothermic storage factors on placental derivatives (cells, explants, spheroids, alginate carriers) were determined. In the second part the effects of cryopreserved placental derivative on female reproductive system component (fibroblasts, neurocells, splenocytes, uterus, ovaries) were studied in vitro. In the third, the effect of cryopreserved placental derivatives on the reproductive system function in the normal and in simulation of typical pathological process (infection, antiphospholipid syndrome, ovarian polycystic syndrome, ovarian dysfunction, trauma, post-chemotherapy premature ovarian failure) was studied. Methods of cell and tissue culturing, light, confocal laser scanning microscopy, flow cytometry, and biochemical methods were used for the placental derivatives` obtaining and characterization. To evaluate the influence of cryopreservation factors, the programmable freezing, cryomicroscopy, slow and rapid freezing methods were used. To evaluate the effect of placental derivatives on the female reproductive system, modeling of pathological conditions in laboratory animals, the histological, morphometric, biochemical methods were used. Computer image processing, confocal microscopy, flow cytometry and statistical data processing were applied as well. It has been found that the explants, placental cells in suspension and in alginate microspheres preserve their structure, viability and metabolic characteristics (according to the vital staining, MTT and resazurin assays) during culturing. The spheroids, formed from the placental cells were unstable, tended to disintegration and adhesion. The cells isolated from placental villi, fetal membranes have the MSCs features (immunophenotype CD90 +, CD73 +, CD105 +, CD34- capable of induced differentiation in the adipogenic, chondrogenic, and osteogenic directions). For the first time it has been demonstrated, that the placental cells in suspension and in alginate microspheres preserved a stable structure, viability and metabolic characteristics for 48 hours, the spheroids did for 24 hours, under the subnormothermic conditions (20°C). When the temperature decreases down to hypothermic conditions (4ºС), the preservation rate decreased to 24 hours for all the placental derivatives. Cryopreservation under 10% dimethylsulfoxide protection and with the cooling rate of 1 °C/min down to -80°C, followed by an immersion into liquid nitrogen allowed the obtaining of the preservation rate for the placental cells and explants higher than 90% on indices of structural integrity and viability, for the cells in alginate spheres this value was about 70 %, for the spheroids that made about 50% with the signs of a significant destruction. For the first time it has been established that typical cryoinjuries of placental explants are the connective tissue ruptures and trophoblast desquamation, resulted from the crystals growing. Typical damage of the spheroids are injuries of cell-tocell relationship by crystals as well as the cell death along the periphery of spheroids. In alginate granules with placental cells in cryopreservation, the zones with large crystals (up to 150 microns) and the ones with small crystals (up to 3 microns), resulting from the interaction of the cryoprotectant with alginate, have been formed. The maximum preservation of placental cells at a level higher than 80% was observed with the use of dimethylsulfoxide, propandiol, ethylene glycol cryoprotectants. When using sucrose, glycerol, the cell viability did not exceed 70%. Replacing DMEM to NaCl, Ringer or Hanks solutions reduced the number of viable cells after cryopreservation. The presence of serum did not change the cryoprotective properties of the media. For the first time it has been shown that for effective cryopreservation of placental cells the cooling mode should be performed at a rate of 1°C/min down to -40°C or lower, followed by an immersion into liquid nitrogen. Repeated placental freeze-thawing of the cells without re-culturing led to a loss of about 50% of cells. Temperature fluctuations within -196ºС- - 100ºС up to 20 times, did not result in the damage of placental cells. With more fluctuation or the temperature fluctuations down to -80°C, the number of cells, their viability, metabolic characteristics were reduced, while the number of apoptotic cells was increased. For the first time it has been demonstrated in vitro, that the media, conditioned by placental cells and explants increase the metabolic activity of neurocells, organotypic cultures of the uterus, suppress it in ovarian cultures, splenocytes and do not change the metabolic activity of fibroblasts. It has been demonstrated that the media conditioned with cryopreserved placental derivatives suppress the metabolic activity of splenocytes bigger than those, conditioned with freshly isolated and have the same effect on metabolic activity and morphological characteristics of neurocells, fibroblasts, organotypic cultures of the uterus and ovaries. For the first time the placental cryopreserved derivatives` influence on the course of experimental gynecological pathology was comprehensively analyzed. Implantation of cryopreserved placenta explants to healthy experimental animals led to hypertrophy of the ovaries, uterus, ovulation and pregnancy delay, it does not affect reproductive indices. It has been shown that the implantation of cryopreserved placental explants in a non-sanitated infectious process reduces the number of pregnant animals from 80 down to 40% and the average number of fetuses due to an increased adhesion formation and activation of inflammatory process. It has been found that the implantation of cryopreserved placental explants in experimental antiphospholipid syndrome can reduce the activity of lymphocytes, the rate of blood coagulation, increase the number of fetuses. In the model of polycystic ovary syndrome, the application of cryopreserved placental explants can recover the estral cycle in 90% of animals; increase the percentage of pregnant animals from 0 up to 40%. In the model of premature ovarian failure after chemotherapy, the application of cryopreserved placental explants restores the estral cycle, sexual function, uterine structure, but not fertility. In the model of ischemic ovarian damage, after the use of cryopreserved placental explants, the number of yellow bodies was restored and the number of fetuses was increased. The methods of cryopreservation and hypothermic storage of tissues and tissue-engineered structures have been developed. For placental derivatives a short-term storage for 24-48 hours, which is most often needed for transportation, it is expediently to use the subormorthermic conditions, i.e. about 20ºC and culture medium with concentration 1×105 cells/ml or 10 ml per 1g of explants. The methods of cryopreservation and short-term hypothermic storage of placental derivatives, based on the substances permitted for usage in clinical practice (propanediol, Ringer solution, 0.9% NaCl) and the equipment available in most hospitals (refrigeration equipment) have been proposed. The methods of rapid evaluation of state and preservation after cryopreservation, hypothermic storage of explants, spheroids from the placenta, which can be used for other tissues, multicellular complexes have been developed. These methods are promising to be used in the practice of low-temperature banks of cells, tissues and organs. The peculiarities of cryopreservation of various multicellular structures have been identified. They allow to improve the methods of cryopreservation of tissues, multicellular structures and to create new tissue-engineered constructs more resistant to cryopreservation. The prospective research directions, possible indications, contraindications for application of placental derivatives in the female reproductive system pathology have been found. Functional endocrine disorders (ovarian insufficiency, polycystic ovary syndrome), autoimmune pathology (antiphospholipid syndrome), ischemic events (ovarian torsion) may be the indications for the placental derivatives application. The presence of infectious pathology is the contraindication to the application of placental derivatives. When placental derivatives intra-operatively are used, the anti-adhesion preventive measures in the form of the barrier gels are recommended.
dc.format.extent325 с.
dc.identifier.citationПрокопюк, В. Ю. Біотехнологія отримання та низькотемпературного зберігання похідних плаценти для лікування гінекологічної патології : дис. … д-ра біол. наук : 03.00.20 - біотехнологія / Прокопюк Володимир Юрійович. – Харків, 2025. – 325 с.
dc.identifier.urihttps://ela.kpi.ua/handle/123456789/73208
dc.language.isouk
dc.publisherІнститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України
dc.publisher.placeХарків
dc.subjectплацента
dc.subjectбіотехнологія
dc.subjectкріоконсервування
dc.subjectнизькотемпературне зберігання
dc.subjectрегенеративна медицина
dc.subjectстовбурові клітини
dc.subjectклітинні культури
dc.subjectгінекологія
dc.subjectplacenta
dc.subjectbiotechnology
dc.subjectcryopreservation
dc.subjectlow-temperature storage
dc.subjectregenerative medicine
dc.subjectstem cells
dc.subjectcell cultures
dc.subjectgynecology
dc.subject.udc606:615.361.014.4:57.086.13:611.013.8+618.1-08](043.3)
dc.titleБіотехнологія отримання та низькотемпературного зберігання похідних плаценти для лікування гінекологічної патології
dc.typeThesis Doctoral

Файли

Контейнер файлів
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз
Назва:
Prokopiuk_dys.pdf
Розмір:
25.58 MB
Формат:
Adobe Portable Document Format
Завантажити
Ліцензійна угода
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз недоступний
Назва:
license.txt
Розмір:
8.98 KB
Формат:
Item-specific license agreed upon to submission
Опис:
Завантажити

Зібрання

Дисертації (вільний доступ)