Біотехнологія препарату з ранозагоювальними властивостями на основі рекомбінантного аналогу гепарин-зв’язувального епідермального фактору росту людини
Вантажиться...
Дата
2026
Автори
Науковий керівник
Назва журналу
Номер ISSN
Назва тому
Видавець
КПІ ім. Ігоря Сікорського
Анотація
Дронько Л.М. Біотехнологія препарату з ранозагоювальними властивостями на основі рекомбінантного аналогу гепарин-зв’язувального епідермального фактору росту людини. - Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 - Біологія (09 - Біологія). - Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського», Київ, 2026.
Дисертаційна робота присвячена комплексному дослідженню науковобіотехнологічних основ створення інноваційного засобу для стимуляції регенеративних процесів шкіри - гелю на основі рекомбінантного аналогу гепаринзв’язувального епідермального фактора росту людини (rhHB-EGF). В роботі вперше в Україні систематизовано результати досліджень, що стосуються одержання rhHB-EGF у прокаріотичній системі експресії, перевірки його фізикохімічних та функціональних характеристик, а також створення та біологічної оцінки препарату у формі гелю з ранозагоювальними властивостями. У світовій практиці одним із перспективних напрямів є використання рекомбінантних факторів росту як компонентів лікарських засобів для регенеративної медицини. Водночас створення стабільних, біологічно активних та економічно доцільних у виробництві продуктів на основі рекомбінантних білків залишається складним науково-технологічним завданням, що потребує оптимізації підходів в розробці та стандартизації біофармацевтичних продуктів. У першому розділі проведено аналіз літературних джерел та підтверджено актуальність створення біомедичних препаратів на основі рекомбінантних факторів росту, зокрема гепарин-зв’язувального епідермального фактора росту людини (HBEGF), для прискорення процесів регенерації шкіри. Встановлено, що HB-EGF відіграє ключову роль у стимуляції проліферації клітин, ангіогенезі та регуляції репаративних процесів, що визначає його значний терапевтичний потенціал при лікуванні опікових та інших ранових пошкоджень. Систематизовано дані щодо фізико-хімічних властивостей HB-EGF, його структурних характеристик та механізмів біологічної активності, що створює наукове підґрунтя для розробки нових фармацевтичних форм. Узагальнено сучасні підходи до доставки HB-EGF у пошкоджені тканини, зокрема використання гелів, наночастинок та генної терапії, серед яких найбільш перспективним для клінічного застосування є гелева форма для нашкірного нанесення. Обґрунтовано вибір гелевої лікарської форми як оптимальної системи доставки, що забезпечує локальність дії, контрольоване вивільнення активної речовини та сприятливе мікросередовище для загоєння ран. У другому розділі наведено характеристику матеріалів, експериментальних моделей та методів, використаних для отримання, фізико-хімічної та біологічної оцінки рекомбінантного фактора росту rhHB-EGF і розробленого на його основі гелевого продукту для трансдермального нанесення. Для досліджень in vitro застосовано культури еукаріотичних клітин (епітеліоцити та фібробласти - лінії Vero, 3T3, L929), а також прокаріотичну систему експресії Escherichia coli BL21 Star (DE3) для одержання рекомбінантного білка 6His-TRX-sHB-EGF. Описано умови культивування клітин, індукції експресії, виділення білка, очищення методом метал-афінної хроматографії та його ренатурації. Ідентифікацію та підтвердження чистоти білка здійснювали методами ДСН-ПААГ-електрофорезу, вестерн-блотингу, непрямого ІФА та MALDI-TOF масспектрометрії. Функціональну активність rhHB-EGF оцінювали за здатністю стимулювати проліферацію фібробластів (МТТ-тест) та взаємодіяти з гепарином (ELISA). Цитотоксичність і механізми клітинної загибелі аналізували за допомогою МТТ-тесту та проточної цитофлуориметрії з визначенням апоптозу і некрозу (Анексин V/PI). Розробку складу гелю супроводжували дослідження його фізико-хімічних характеристик: в’язкості, pH, стабільності та морфометричних параметрів. Запропоновано методи контролю якості готового препарату, що включають ідентифікацію активних і допоміжних компонентів, кількісне визначення HB-EGF, оцінку домішок, мікробіологічну чистоту та вміст ендотоксинів відповідно до вимог чинних нормативних документів. Дослідження in vivo проведено на мишах, мурчаках і кролях з метою оцінки подразнювальної, сенсибілізуючої дії та ефективності загоєння ран (морфометричний і гістологічний аналіз). Експерименти виконано з дотриманням міжнародних і національних біоетичних стандартів. Загальна методологія ґрунтувалася на комплексному застосуванні біотехнологічних, імунологічних, біохімічних, фізико-хімічних та статистичних методів аналізу, що забезпечило всебічну оцінку безпечності, біологічної активності та якості розробленого ранозагоювального гелю. У третьому розділі представлено результати комплексної розробки складу та технології гелю для зовнішнього застосування з ранозагоювальними властивостями на основі rhHB-EGF. Проведено оптимізацію процесів виділення та очищення rhHB-EGF із бактеріальної системи експресії шляхом модифікації ключових параметрів метал-афінної хроматографії, вибору клітинної фракції, застосування ферментативної обробки та відмови від стадії рефолдингу. Запропонована схема забезпечила підвищення ступеня очищення та збереження нативних властивостей білка. Фізико-хімічні характеристики отриманого rhHB-EGF підтверджено методами ДСН-ПААГ та MALDI-TOF масспектрометрії, що засвідчило відповідність молекулярної маси й амінокислотної послідовності теоретично очікуваним значенням. Функціональну активність субстанції доведено за допомогою МТТ-тесту на клітинній лінії 3Т3 та імуноферментного аналізу зв’язування з гепарином, що підтверджує збереження біологічно значущих доменів молекули. Обґрунтовано склад гелеподібної лікарської форми шляхом багатоваріантного скринінгу гелеутворювачів, буферних систем та консервантів при фіксованій концентрації rhHB-EGF (0,015%). Визначено оптимальний склад (2,0% натрію гіалуронату, 0,2% калію сорбату у фосфатно-сольовому середовищі), що забезпечує належні органолептичні, реологічні та біофармацевтичні характеристики. Розроблено параметри аналітичної стандартизації гелю відповідно до вимог ДФУ, ЄФ та ICH Q6A, сформовано специфікації контролю якості та підтверджено відтворюваність технології на трьох лабораторних серіях. Отримані результати доводять стабільність фізико-хімічних, мікробіологічних та функціональних показників препарату й обґрунтовують перспективність його подальшого впровадження як засобу для стимуляції регенерації тканин. Четвертий розділ присвячено результатам комплексної доклінічної оцінки безпечності та терапевтичної ефективності розробленого гелю для зовнішнього застосування на основі рекомбінантного людського гепарин-зв’язувального епідермального фактора росту. Оцінку безпечності проведено із застосуванням in vitro та in vivo підходів. У дослідженнях in vitro (МТТ-тест, проточна цитометрія з Анексин V/PI, А5-EGFP та пропідій йодидом) на клітинних лініях 3T3, Vero та L929 встановлено відсутність цитотоксичної, проапоптичної та некротичної дії rhHBEGF у робочих концентраціях (500 - 1000 нг/мл). Також під час дослідження виявлено стимуляцію проліферації фібробластів, що підтверджує біосумісність та біологічну активність досліджуваного засобу. In vivo дослідження подразнювальної та сенсибілізуючої дії на мишах, мурчаках і кролях показали мінімальний рівень місцевої реактивності шкіри (низькі значення індексу первинного подразнення) та відсутність сенсибілізації навіть після багаторазового нанесення. Отримані дані свідчать про високий профіль безпечності гелю при місцевому застосування. Ефективність засобу вивчали на моделі хімічного опіку (10% розчину параформальдегіду) шкіри у мишей. Морфометричний аналіз продемонстрував прискорене скорочення (до 12 діб) площі рани у групі лікування гелем з rhHB-EGF (до 73%) порівняно з контролем. Також відзначено скорочення термінів відшарування кірки та повної реепітелізації, в порівнянні з контролем. Гістологічний аналіз підтвердив більш активну проліферацію епітеліальних клітин, формування грануляційної тканини, зменшення запальної інфільтрації та відновлення структурної організації дерми й епідермісу, порівняно з зразками з тканин контрольної групи тварин. Отже, наведені в результати доводять, що гель на основі rhHB-EGF є біосумісним, не чинить токсичної чи сенсибілізуючої дії та проявляє виражений ранозагоювальний ефект на моделях in vivo. Отримані дані обґрунтовують перспективність подальших доклінічних і клінічних досліджень розробленого препарату як інноваційного засобу для лікування опікових та хімічних уражень шкіри. Практична цінність дисертаційної роботи полягає у науковому обґрунтуванні та експериментальному підтвердженні можливості створення безпечного й ефективного ранозагоювального засобу для зовнішнього застосування на основі rhHB-EGF. Показано, що застосування гелю з rhHB-EGF достовірно прискорює процеси регенерації шкіри при хімічних ушкодженнях: скорочується площа рани, зменшується тривалість запальної фази, активізується проліферація клітин епідермісу та формування грануляційної тканини. Це створює передумови для впровадження препарату у практику лікування опікових, післяопераційних та травматичних ушкоджень шкіри. Практична значущість роботи також полягає у: - можливості використання отриманих результатів при розробці нових ранозагоювальних засобів біотехнологічного походження на основі рекомбінантних білків; - удосконаленні підходів до оцінки безпечності біофармацевтичних засобів відповідно до сучасних міжнародних стандартів; - розширенні вітчизняної лінійки інноваційних біофармацевтичних продуктів для регенеративної медицини. Таким чином, одержані результати мають прикладне значення для біотехнології, біомедичної інженерії та клінічної практики й можуть слугувати науковим підґрунтям для створення конкурентоспроможного вітчизняного препарату регенеративної дії.
Опис
Ключові слова
гепарин-зв’язувальний епідермальний фактор росту, рекомбінантний білок, біотехнологія, гель для зовнішнього застосування, фармацевтична композиція, регенерація шкіри, загоєння ран, оцінка ефективності загоєння, стандартизація, регенеративна медицина, in vitro дослідження, цитотоксичність, heparin-binding epidermal growth factor, recombinant protein, biotechnology, gel for external use, pharmaceutical composition, skin regeneration, wound healing, assessment of healing efficacy, standardization, regenerative medicine, in vitro studies, cytotoxicity
Бібліографічний опис
Дронько, Л. М. Біотехнологія препарату з ранозагоювальними властивостями на основі рекомбінантного аналогу гепарин-зв’язувального епідермального фактору росту людини : дис. … д-ра філософії : 091 Біологія / Дронько Лілія Миколаївна. – Київ, 2026. – 213 с.