Біотехнологія препарату з ранозагоювальними властивостями на основі рекомбінантного аналогу гепарин-зв’язувального епідермального фактору росту людини
| dc.contributor.advisor | Луценко, Тетяна Миколаївна | |
| dc.contributor.advisor | Колибо, Денис Володимирович | |
| dc.contributor.author | Дронько, Лілія Миколаївна | |
| dc.date.accessioned | 2026-06-02T09:08:15Z | |
| dc.date.available | 2026-06-02T09:08:15Z | |
| dc.date.issued | 2026 | |
| dc.description.abstract | Дронько Л.М. Біотехнологія препарату з ранозагоювальними властивостями на основі рекомбінантного аналогу гепарин-зв’язувального епідермального фактору росту людини. - Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 - Біологія (09 - Біологія). - Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського», Київ, 2026. Дисертаційна робота присвячена комплексному дослідженню науковобіотехнологічних основ створення інноваційного засобу для стимуляції регенеративних процесів шкіри - гелю на основі рекомбінантного аналогу гепаринзв’язувального епідермального фактора росту людини (rhHB-EGF). В роботі вперше в Україні систематизовано результати досліджень, що стосуються одержання rhHB-EGF у прокаріотичній системі експресії, перевірки його фізикохімічних та функціональних характеристик, а також створення та біологічної оцінки препарату у формі гелю з ранозагоювальними властивостями. У світовій практиці одним із перспективних напрямів є використання рекомбінантних факторів росту як компонентів лікарських засобів для регенеративної медицини. Водночас створення стабільних, біологічно активних та економічно доцільних у виробництві продуктів на основі рекомбінантних білків залишається складним науково-технологічним завданням, що потребує оптимізації підходів в розробці та стандартизації біофармацевтичних продуктів. У першому розділі проведено аналіз літературних джерел та підтверджено актуальність створення біомедичних препаратів на основі рекомбінантних факторів росту, зокрема гепарин-зв’язувального епідермального фактора росту людини (HBEGF), для прискорення процесів регенерації шкіри. Встановлено, що HB-EGF відіграє ключову роль у стимуляції проліферації клітин, ангіогенезі та регуляції репаративних процесів, що визначає його значний терапевтичний потенціал при лікуванні опікових та інших ранових пошкоджень. Систематизовано дані щодо фізико-хімічних властивостей HB-EGF, його структурних характеристик та механізмів біологічної активності, що створює наукове підґрунтя для розробки нових фармацевтичних форм. Узагальнено сучасні підходи до доставки HB-EGF у пошкоджені тканини, зокрема використання гелів, наночастинок та генної терапії, серед яких найбільш перспективним для клінічного застосування є гелева форма для нашкірного нанесення. Обґрунтовано вибір гелевої лікарської форми як оптимальної системи доставки, що забезпечує локальність дії, контрольоване вивільнення активної речовини та сприятливе мікросередовище для загоєння ран. У другому розділі наведено характеристику матеріалів, експериментальних моделей та методів, використаних для отримання, фізико-хімічної та біологічної оцінки рекомбінантного фактора росту rhHB-EGF і розробленого на його основі гелевого продукту для трансдермального нанесення. Для досліджень in vitro застосовано культури еукаріотичних клітин (епітеліоцити та фібробласти - лінії Vero, 3T3, L929), а також прокаріотичну систему експресії Escherichia coli BL21 Star (DE3) для одержання рекомбінантного білка 6His-TRX-sHB-EGF. Описано умови культивування клітин, індукції експресії, виділення білка, очищення методом метал-афінної хроматографії та його ренатурації. Ідентифікацію та підтвердження чистоти білка здійснювали методами ДСН-ПААГ-електрофорезу, вестерн-блотингу, непрямого ІФА та MALDI-TOF масспектрометрії. Функціональну активність rhHB-EGF оцінювали за здатністю стимулювати проліферацію фібробластів (МТТ-тест) та взаємодіяти з гепарином (ELISA). Цитотоксичність і механізми клітинної загибелі аналізували за допомогою МТТ-тесту та проточної цитофлуориметрії з визначенням апоптозу і некрозу (Анексин V/PI). Розробку складу гелю супроводжували дослідження його фізико-хімічних характеристик: в’язкості, pH, стабільності та морфометричних параметрів. Запропоновано методи контролю якості готового препарату, що включають ідентифікацію активних і допоміжних компонентів, кількісне визначення HB-EGF, оцінку домішок, мікробіологічну чистоту та вміст ендотоксинів відповідно до вимог чинних нормативних документів. Дослідження in vivo проведено на мишах, мурчаках і кролях з метою оцінки подразнювальної, сенсибілізуючої дії та ефективності загоєння ран (морфометричний і гістологічний аналіз). Експерименти виконано з дотриманням міжнародних і національних біоетичних стандартів. Загальна методологія ґрунтувалася на комплексному застосуванні біотехнологічних, імунологічних, біохімічних, фізико-хімічних та статистичних методів аналізу, що забезпечило всебічну оцінку безпечності, біологічної активності та якості розробленого ранозагоювального гелю. У третьому розділі представлено результати комплексної розробки складу та технології гелю для зовнішнього застосування з ранозагоювальними властивостями на основі rhHB-EGF. Проведено оптимізацію процесів виділення та очищення rhHB-EGF із бактеріальної системи експресії шляхом модифікації ключових параметрів метал-афінної хроматографії, вибору клітинної фракції, застосування ферментативної обробки та відмови від стадії рефолдингу. Запропонована схема забезпечила підвищення ступеня очищення та збереження нативних властивостей білка. Фізико-хімічні характеристики отриманого rhHB-EGF підтверджено методами ДСН-ПААГ та MALDI-TOF масспектрометрії, що засвідчило відповідність молекулярної маси й амінокислотної послідовності теоретично очікуваним значенням. Функціональну активність субстанції доведено за допомогою МТТ-тесту на клітинній лінії 3Т3 та імуноферментного аналізу зв’язування з гепарином, що підтверджує збереження біологічно значущих доменів молекули. Обґрунтовано склад гелеподібної лікарської форми шляхом багатоваріантного скринінгу гелеутворювачів, буферних систем та консервантів при фіксованій концентрації rhHB-EGF (0,015%). Визначено оптимальний склад (2,0% натрію гіалуронату, 0,2% калію сорбату у фосфатно-сольовому середовищі), що забезпечує належні органолептичні, реологічні та біофармацевтичні характеристики. Розроблено параметри аналітичної стандартизації гелю відповідно до вимог ДФУ, ЄФ та ICH Q6A, сформовано специфікації контролю якості та підтверджено відтворюваність технології на трьох лабораторних серіях. Отримані результати доводять стабільність фізико-хімічних, мікробіологічних та функціональних показників препарату й обґрунтовують перспективність його подальшого впровадження як засобу для стимуляції регенерації тканин. Четвертий розділ присвячено результатам комплексної доклінічної оцінки безпечності та терапевтичної ефективності розробленого гелю для зовнішнього застосування на основі рекомбінантного людського гепарин-зв’язувального епідермального фактора росту. Оцінку безпечності проведено із застосуванням in vitro та in vivo підходів. У дослідженнях in vitro (МТТ-тест, проточна цитометрія з Анексин V/PI, А5-EGFP та пропідій йодидом) на клітинних лініях 3T3, Vero та L929 встановлено відсутність цитотоксичної, проапоптичної та некротичної дії rhHBEGF у робочих концентраціях (500 - 1000 нг/мл). Також під час дослідження виявлено стимуляцію проліферації фібробластів, що підтверджує біосумісність та біологічну активність досліджуваного засобу. In vivo дослідження подразнювальної та сенсибілізуючої дії на мишах, мурчаках і кролях показали мінімальний рівень місцевої реактивності шкіри (низькі значення індексу первинного подразнення) та відсутність сенсибілізації навіть після багаторазового нанесення. Отримані дані свідчать про високий профіль безпечності гелю при місцевому застосування. Ефективність засобу вивчали на моделі хімічного опіку (10% розчину параформальдегіду) шкіри у мишей. Морфометричний аналіз продемонстрував прискорене скорочення (до 12 діб) площі рани у групі лікування гелем з rhHB-EGF (до 73%) порівняно з контролем. Також відзначено скорочення термінів відшарування кірки та повної реепітелізації, в порівнянні з контролем. Гістологічний аналіз підтвердив більш активну проліферацію епітеліальних клітин, формування грануляційної тканини, зменшення запальної інфільтрації та відновлення структурної організації дерми й епідермісу, порівняно з зразками з тканин контрольної групи тварин. Отже, наведені в результати доводять, що гель на основі rhHB-EGF є біосумісним, не чинить токсичної чи сенсибілізуючої дії та проявляє виражений ранозагоювальний ефект на моделях in vivo. Отримані дані обґрунтовують перспективність подальших доклінічних і клінічних досліджень розробленого препарату як інноваційного засобу для лікування опікових та хімічних уражень шкіри. Практична цінність дисертаційної роботи полягає у науковому обґрунтуванні та експериментальному підтвердженні можливості створення безпечного й ефективного ранозагоювального засобу для зовнішнього застосування на основі rhHB-EGF. Показано, що застосування гелю з rhHB-EGF достовірно прискорює процеси регенерації шкіри при хімічних ушкодженнях: скорочується площа рани, зменшується тривалість запальної фази, активізується проліферація клітин епідермісу та формування грануляційної тканини. Це створює передумови для впровадження препарату у практику лікування опікових, післяопераційних та травматичних ушкоджень шкіри. Практична значущість роботи також полягає у: - можливості використання отриманих результатів при розробці нових ранозагоювальних засобів біотехнологічного походження на основі рекомбінантних білків; - удосконаленні підходів до оцінки безпечності біофармацевтичних засобів відповідно до сучасних міжнародних стандартів; - розширенні вітчизняної лінійки інноваційних біофармацевтичних продуктів для регенеративної медицини. Таким чином, одержані результати мають прикладне значення для біотехнології, біомедичної інженерії та клінічної практики й можуть слугувати науковим підґрунтям для створення конкурентоспроможного вітчизняного препарату регенеративної дії. | |
| dc.description.abstractother | Dronko L.M. Biotechnology of a wound-healing preparation based on a recombinant analogue of human heparin-binding epidermal growth factor. - Qualification scientific work in the form of a manuscript. Dissertation for the degree of Doctor of Philosophy in the specialty 091 - Biology (09 - Biology). - National Technical University of Ukraine “Igor Sikorsky Kyiv Polytechnic Institute”, Kyiv, 2026. The dissertation is devoted to a comprehensive study of the scientific and biotechnological foundations for the development of an innovative agent for stimulating skin regenerative processes - a gel based on a recombinant analogue of the human heparin-binding epidermal growth factor (rhHB-EGF). For the first time in Ukraine, the work systematizes research results related to the production of rhHB-EGF in a prokaryotic expression system, verification of its physicochemical and functional characteristics, and the development and biological evaluation of a gel formulation with wound-healing properties intended for therapeutic use. In global practice, one of the promising approaches in regenerative medicine is the use of recombinant growth factors as components of medicinal products. However, the development of stable, biologically active, and economically feasible recombinant protein-based products remains a complex scientific and technological challenge that requires optimization of approaches to the development and standardization of biopharmaceutical products. The first chapter presents an analysis of literature sources and confirms the relevance of developing biomedical preparations based on recombinant growth factors, particularly human heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF), to accelerate skin regeneration processes. HB-EGF has been shown to play a key role in stimulating cell proliferation, angiogenesis, and regulation of reparative processes, which determines its significant therapeutic potential in the treatment of burn and other wound injuries. Data on the physicochemical properties of HB-EGF, its structural characteristics, and mechanisms of biological activity are systematized, providing a scientific basis for the development of new pharmaceutical formulations. Modern approaches to the delivery of HB-EGF into damaged tissues are summarized, including gels, hydrogels, nanoparticles, and gene therapy. Among these, the gel formulation for topical application appears to be the most promising for clinical use. The choice of a gel dosage form is substantiated as an optimal delivery system that ensures localized action, controlled release of the active substance, and a favorable microenvironment for wound healing. The second chapter describes the characteristics of materials, experimental models, and methods used for the production, physicochemical characterization, and biological evaluation of the recombinant growth factor rhHB-EGF and the wound-healing gel developed on its basis. For in vitro studies, cultures of eukaryotic cells (epithelial cells and fibroblasts - Vero, 3T3, and L929 cell lines) were used, as well as the prokaryotic expression system Escherichia coli BL21 Star (DE3) for the production of the recombinant protein 6HisTRX-sHB-EGF. The conditions of cell cultivation, induction of expression, protein isolation, purification by metal-affinity chromatography, and renaturation are described. Protein identification and purity confirmation were performed using SDS-PAGE electrophoresis, Western blotting, indirect ELISA, and MALDI-TOF mass spectrometry. Functional activity of rhHB-EGF was evaluated by its ability to stimulate fibroblast proliferation (MTT assay) and interact with heparin (ELISA). Cytotoxicity and mechanisms of cell death were analyzed using the MTT assay and flow cytometry with determination of apoptosis and necrosis (Annexin V/PI). The development of the gel formulation was accompanied by studies of its physicochemical characteristics, including viscosity, pH, stability, and morphometric parameters. Methods for quality control of the finished product were proposed, including identification of active and auxiliary components, quantitative determination of HB-EGF, impurity assessment, microbiological purity testing, and endotoxin content determination in accordance with current regulatory requirements. In vivo studies were performed on mice, guinea pigs, and rabbits with evaluation of irritant and sensitizing effects as well as wound-healing efficacy (morphometric and histological analysis). All experiments were conducted in accordance with international and national bioethical standards. The overall methodology was based on the integrated application of biotechnological, immunological, biochemical, physicochemical, and statistical analysis methods, which ensured a comprehensive evaluation of the safety, biological activity, and quality of the developed wound-healing gel. The third chapter presents the results of the comprehensive development of the composition and technology of a topical gel with wound-healing properties based on rhHB-EGF. Optimization of rhHB-EGF isolation and purification from the bacterial expression system was performed by modifying key parameters of metal-affinity chromatography, selecting the appropriate cellular fraction, applying enzymatic processing, and eliminating the refolding stage. The proposed scheme ensured an increased purification degree while preserving the native properties of the protein. Physicochemical characteristics of the obtained rhHB-EGF were confirmed by SDSPAGE and MALDI-TOF mass spectrometry, demonstrating correspondence of the molecular weight and amino acid sequence to theoretically expected values. Functional activity of the substance was demonstrated using the MTT assay on the 3T3 cell line and by enzyme-linked immunosorbent assay for heparin binding, confirming the preservation of biologically significant domains of the molecule. The composition of the gel dosage form was substantiated through multivariate screening of gelling agents, buffer systems, and preservatives at a fixed rhHB-EGF concentration (0.015%). The optimal composition was determined (2.0% sodium hyaluronate, 0.2% potassium sorbate in a phosphate-buffered medium), providing appropriate organoleptic, rheological, and biopharmaceutical properties. Parameters for analytical standardization of the gel were developed according to the requirements of the State Pharmacopoeia of Ukraine, the European Pharmacopoeia, and ICH Q6A guidelines. Quality control specifications were established, and reproducibility of the technology was confirmed using three laboratory batches. The obtained results demonstrate stability of physicochemical, microbiological, and functional parameters of the preparation and justify its prospects for further implementation as an agent for stimulating tissue regeneration. The fourth chapter is devoted to the results of a comprehensive preclinical evaluation of the safety and therapeutic efficacy of the developed topical gel based on recombinant human heparin-binding epidermal growth factor (rhHB-EGF). Safety assessment was performed using both in vitro and in vivo approaches. In vitro studies (MTT assay and flow cytometry with Annexin A5-EGFP and propidium iodide) on 3T3, Vero, and L929 cell lines demonstrated the absence of cytotoxic, pro-apoptotic, and necrotic effects of rhHB-EGF at working concentrations (500 - 1000 ng/mL). Stimulation of fibroblast proliferation was observed, confirming the biocompatibility and biological activity of the studied agent. In vivo studies of irritant and sensitizing effects in mice, guinea pigs, and rabbits showed minimal local skin reactivity (low primary irritation index values) and absence of sensitization even after repeated application. These findings indicate a high safety profile of the gel for topical use. The efficacy of the preparation was studied using a model of chemical skin burns in mice. Morphometric analysis demonstrated accelerated reduction of wound area in the group treated with rhHB-EGF gel (up to 73%) compared with the control group. A reduction in the time required for scab detachment and complete re-epithelialization was also observed. Histological analysis confirmed enhanced proliferation of epithelial cells, formation of granulation tissue, decreased inflammatory infiltration, and restoration of the structural organization of the dermis and epidermis. Thus, the obtained results demonstrate that the rhHB-EGF-based gel is biocompatible, does not exhibit toxic or sensitizing effects, and shows a pronounced wound-healing activity. The obtained data substantiate the prospects for further preclinical and clinical studies of the developed preparation as an innovative agent for the treatment of burn and chemical skin injuries. The practical value of the dissertation lies in the scientific substantiation and experimental confirmation of the possibility of creating a safe and effective woundhealing agent for topical application based on rhHB-EGF. It has been demonstrated that the use of rhHB-EGF gel significantly accelerates skin regeneration processes in chemical injuries: wound area decreases, the duration of the inflammatory phase is reduced, proliferation of epidermal cells is activated, and formation of granulation tissue is enhanced. This creates prerequisites for the implementation of the preparation in the treatment of burn, postoperative, and traumatic skin injuries. The practical significance of the work also includes: - the possibility of using the obtained results in the development of new wound-healing agents of biotechnological origin based on recombinant proteins; - improvement of approaches to safety assessment of biopharmaceutical products in accordance with modern international standards; - expansion of the national range of innovative biopharmaceutical products for regenerative medicine. Thus, the obtained results have practical importance for pharmaceutical technology, biomedical engineering, and clinical practice and may serve as a scientific basis for the development of a competitive domestic regenerative medicinal product. | |
| dc.format.extent | 213 с. | |
| dc.identifier.citation | Дронько, Л. М. Біотехнологія препарату з ранозагоювальними властивостями на основі рекомбінантного аналогу гепарин-зв’язувального епідермального фактору росту людини : дис. … д-ра філософії : 091 Біологія / Дронько Лілія Миколаївна. – Київ, 2026. – 213 с. | |
| dc.identifier.uri | https://ela.kpi.ua/handle/123456789/81411 | |
| dc.language.iso | uk | |
| dc.publisher | КПІ ім. Ігоря Сікорського | |
| dc.publisher.place | Київ | |
| dc.subject | гепарин-зв’язувальний епідермальний фактор росту | |
| dc.subject | рекомбінантний білок | |
| dc.subject | біотехнологія | |
| dc.subject | гель для зовнішнього застосування | |
| dc.subject | фармацевтична композиція | |
| dc.subject | регенерація шкіри | |
| dc.subject | загоєння ран | |
| dc.subject | оцінка ефективності загоєння | |
| dc.subject | стандартизація | |
| dc.subject | регенеративна медицина | |
| dc.subject | in vitro дослідження | |
| dc.subject | цитотоксичність | |
| dc.subject | heparin-binding epidermal growth factor | |
| dc.subject | recombinant protein | |
| dc.subject | biotechnology | |
| dc.subject | gel for external use | |
| dc.subject | pharmaceutical composition | |
| dc.subject | skin regeneration | |
| dc.subject | wound healing | |
| dc.subject | assessment of healing efficacy | |
| dc.subject | standardization | |
| dc.subject | regenerative medicine | |
| dc.subject | in vitro studies | |
| dc.subject | cytotoxicity | |
| dc.subject.udc | 602:616.12-089.843](043.3) | |
| dc.title | Біотехнологія препарату з ранозагоювальними властивостями на основі рекомбінантного аналогу гепарин-зв’язувального епідермального фактору росту людини | |
| dc.title.alternative | Biotechnology of a wound-healing preparation based on a recombinant analogue of human heparin-binding epidermal growth factor | |
| dc.type | Thesis Doctoral |
Файли
Контейнер файлів
1 - 1 з 1
Ліцензійна угода
1 - 1 з 1
Ескіз недоступний
- Назва:
- license.txt
- Розмір:
- 8.98 KB
- Формат:
- Item-specific license agreed upon to submission
- Опис: