Розробка технології виробництва рибофлавіну і ефірної олії, що продукуються Eremothecium ashbyi Guill.

Скорочена інформація про документ
dc.contributor.advisorДуган, Олексій Мартем’янович
dc.contributor.authorПоліщук, Валентина Юріївна
dc.date.accessioned2018-06-06T14:04:00Z
dc.date.available2018-06-06T14:04:00Z
dc.date.issued2018
dc.description.abstractenA well-known microorganism-producer of riboflavin is ascomycete Eremothecium ashbyi used in industry. Besides overexpression of riboflavin, E. ashbyi also performs synthesis of flavinadeninedinucleotide (FAD). Using E. ashbyi, one can obtain either forage riboflavin used as a feed additive for livestock, or, using certain isolation and purification methods, riboflavin of medical purpose. Concomitantly with riboflavin synthesis, E. ashbyi performs synthesis of essential oil, identical by its aroma and properties to essential oil derived from rose petals. It contains such aromatic substances as geraniol (69.5–84.5%), nerol, linalool, and β-phenylethanol (12.7–27.7%). This allows viewing E. ashbyi as a promising producer of aromatic substances, which are necessary for perfume and toiletry industry. Biotechnology of rose essential oil, one of the most valuable in the world, has not been developed so far. At present, manufacture of riboflavin using biotechnology is not established in Ukraine, and the potential of concomitant production of essential oil as well makes the topic of this thesis urgent, timely, and important. During the work, morphological and cultural peculiarities of the strain Eremothecium ashbyi F-340 have been investigated. It belongs to ascomycetes not generating ascocarps, has true dichotomic branched bright-yellow mycelium composed of multinucleate cells. Mycelium color is due to the presence of riboflavin, which is accumulated in such quantities that it is precipitated in vacuoles as crystals. Natural variability of the strain has been shown. The fungus forms pigmented yellow and orange colonies with high ability to riboflavin biosynthesis, and white colonies with low biosynthetic ability. Most frequently, white colonies develop upon archive culture reactivation and almost do not appear upon regular reinoculations and alterations of liquid and agar nutrient media. The strain storage conditions have been investigated. It has been established that short-term storage of E. ashbyi F-340 in the active state is possible on agar glucose-peptone-yeast and soybean media at storage temperature 5°C. Long-term storage of E. ashbyi culture (for 7 months) is possible only at room temperature. Temperature effects on viability of Eremothecium ashbyi F-340 mycelium have been investigated. The lower limit temperature for E. ashbyi is 4°С. The upper limit temperature is equal to 38°С. Minor growth of the fungus is still observed at this temperature, and at 39°С no mycelium growth is observed, and growth restoration at 28°С is not observed. Growth dynamics of E. ashbyi strain F-340 in submerged culture follows the known regularities for periodic cultures. Exponential growth phase lasts for about 2 days; after this, growth deceleration and culture switch into stationery growth phase are observed; the latter one lasts for about 5 days of culturing, after which the culture is switched into die-off or autolysis phase. It has been established that pH decrease to 5.2 occurs during intensive strain growth; intensive riboflavin accumulation in cultural fluid and biomass is associated with pH increase to 7.8. The most intensive riboflavin accumulation occurs in stationery growth phase on culturing day 3–4, and its concentration reaches 341,6 mg/dm3. The second stage of riboflavin accumulation occurs on day 5-7 and is associated with culture autolysis; riboflavin content reaches 55,22,7 mg/dm3. Riboflavin is accumulated at the beginning in E.ashbyi mycelium, where it reaches the level of 8.1-10.7 mg/g of dry biomass and remains at that level until completion of culturing. Despite continuous maintenance selection during the strain culturing under laboratory conditions for 3 years, gradual considerable decrease in riboflavin accumulation and relevant increase in biomass accumulation level has been observed. It is known from literature data that riboflavin overexpression by fungus E. ashbyi in natural conditions occurs as a defense reaction on the effect of sun ultraviolet radiation. That is why we suggested to perform UV irradiation of the producer in order to increase riboflavin synthesis. Irradiation of the producer cultural fluid results in increase of riboflavin biosynthesis by 72-74%, and irradiation of aqueous suspension of mycelium of the producer strain results in synthesis increase by 80%. It has been established that the highest riboflavin yield is achieved when the inoculum aged 3-4 days in quantity 1% is used. The effect of culturing conditions on biosynthetic ability of the producer has been investigated at the following stage. It has been shown that the initial pH level of media intended for biomass and riboflavin production has to be different. In order to obtain maximum quantities of biomass and inoculum, it is expedient to adjust the medium pH to the level 5.5–6.0, and for maximum riboflavin accumulation, initial medium рН has to be 7.5. It has been established that, under aeration conditions on a rocker at 180 rpm, 70 % more riboflavin is synthesized compared to 70 rpm. E. ashbyi is capable to growth in a wide range of temperatures from 20 to 38С. The optimal temperature for maximum target product yield is 27-29С. The effect of various carbon sources on biomass accumulation and riboflavin synthesis by E. ashbyi strain F-340 has been studied. Monosaccharides (fructose, galactose) and hexatomic alcohol sorbitol are better suitable for riboflavin synthesis, and biomass is accumulated better in the presence of fructose, sucrose, and glycerol in the medium. The best nitrogen source for E.ashbyi F-340 turned out to be yeast extract; riboflavin quantity synthesized in a medium with yeast extract was 54% more compared to other nitrogen sources. Nevertheless, no medium for Eremothecium ashbyi culturing containing the said carbohydrates and being cheap and technological enough has been suggested yet. In order to solve this problem, we have suggested to use such a promising natural carbon source as glucose-fructose syrup (GFS), manufactured from corn starch via its enzymatic hydrolysis to glucose with following isomerization of glucose parts into fructose and further purification. It has been shown that the highest vitamin quantity is synthesized with the use of GFS-10 (140 mg/dm3), which is 7 times as high as in a medium with glucose, and 3.8 times as high as in a medium with fructose. For the nutrient medium optimization, we have planned a complete factorial experiment at two levels for 3 factors; the planning matrix was supplemented with “star” points, and orthographic central composite design of second order for 3-factor experiment has been obtained. As a result of calculations, regression equation of the second order has been obtained. Statistical significance of the equation coefficients was verified according to Student’s criterion, and adequacy of the obtained equation was verified according to Fisher’s criterion. As a result of mathematical processing of experimental data, we have obtained the regression equation of relation between riboflavin concentration in cultural fluid and concentrations of GFS-10 (m), yeast extract (w) and peptone (v): Y1= –758.483+41.029·m+9.959·w+5.777·v+0.693·m·w–0.472·m·v–3.51·w·v– –0.547·m2+5.701·v2 Analyzing the response surfaces, we have established the composition of modified medium: optimal GFS-10 concentration for maximum riboflavin accumulation is 40 g/dm3, and concentrations of yeast extract and peptone in the medium are 10 and 1 g/dm3, respectively. Riboflavin concentration observed during culturing on modified medium in cultural fluid is 350.4 mg/dm3, which is 17 times higher than on GPY medium and 2.5 times higher than on initial medium with GFS- 10. Testing of essential oil content in cultural medium was performed via triple extraction with hexane with further removal of the solvent. Wide range of variation of essential oil content has been shown. The highest quantity is observed in the medium containing GFS-10 (273…420 mg/dm3) as carbon source. Essential oil quantity is increased with increase of GSF concentration in the medium. Technological flow chart for concomitant production of riboflavin and essential oil production by hydrodistillation with further separation of riboflavin and essential oil isolation flows is provided. Scientific novelty of the obtained results: - growth dynamics, biomass yield, riboflavin and essential oil accumulation by the selected producer strain Eremothecium ashbyi have been investigated in media with different nutrition sources; - composition and acid content of media, favorable for the growth of the producer strain in submerged culture, have been determined; - rational biotechnological parameters for achievement of maximum riboflavin and essential oil yield have been determined: culturing temperature 27-29С, initial medium pH 7,5, stirring 180 rpm; - nutrient medium for riboflavin and essential oil accumulation has been optimized using experiment planning methods (such medium includes GFS-10, yeast extract and peptone), and possibility of concomitant production of these products has been verified; - biotechnology for riboflavin and essential oil production from domestic renewable raw material – glucose-fructose syrup manufactured from corn – has been scientifically justified are developed for the first time.uk
dc.description.abstractukВідомим мікроорганізмом–продуцентом рибофлавіну є аскоміцет Eremothecium ashbyi, який використовується у промисловості. Крім надсинтезу рибофлавіну E. ashbyi здійснює синтез флавінаденіндинуклеотиду (ФАД). За допомогою E. ashbyi можна отримувати як кормовий рибофлавін, що використовується в якості кормової добавки для тварин, так і, при застосуванні певних методів виділення та очистки, рибофлавін медичного призначення. Одночасно з синтезом рибофлавіну E. ashbyi здійснює синтез ефірної олії, яка за ароматом та своїми властивостями ідентична ефірній олії, отриманій з пелюсток троянди. У своєму складі вона містить такі ароматичні речовини, як гераніол (69,5–84,5%), нерол, лінаноол та β-фенілетанол (12,7–27,7%). Це дає можливість розглядати E. ashbyi як перспективний продуцент ароматичних речовин, що є необхідними для парфюмерно-косметичної промисловості. Біотехнологія трояндової ефірної олії, однієї з найцінніших олій в світі, досі не розроблена. На даний момент в Україні не налагоджено виробництво рибофлавіну за допомогою біотехнології, а можливість одночасного отримання ще й ефірної олії робить тему дисертаційної роботи актуальною, своєчасною та важливою. В ході виконання роботи досліджено морфологічні та культуральні особливості штаму Eremothecium ashbyi F-340. Він відноситься до аскоміцетів, що не утворюють плодові тіла, має справжній дихотомічний розгалужений міцелій яскраво-жовтого кольору, який складається з багатоядерних клітин. Колір міцелію обумовлений присутністю рибофлавіну, який накопичується в такій кількості, що випадає у вигляді кристалів в вакуолях. Показана природна мінливість штаму. Гриб утворює пігментовані жовті та жовтогарячі колонії з високою здатністю до біосинтезу рибофлавіну, та білі колонії, з низькою. Найчастіше колонії білого кольору з’являються при відновленні музейної культури і майже не з’являються при регулярних пересівах культури та чергуванні рідких та агаризованих поживних середовищ. Досліджено умови зберігання штаму. Встановлено, що короткотривале зберігання E. ashbyi F-340 у активному стані можливе на агаризованих глюкозопептонно-дріжджовому та соєвому середовищах за температури зберігання 5°C. Довготривале зберігання культури E. ashbyi (протягом 7 місяців) можливе лише за кімнатної температури. Досліджено вплив температури на життєдіяльність міцелію Eremothecium ashbyi F-340. Нижня гранична температура для E. ashbyi становить 4°С. Верхня гранична температура дорівнює 38°С. За цієї температури ще спостерігається незначний ріст гриба, а вже при 39°С ріст міцелію не спостерігається та відновлення росту при 28°С не відбувається. Динаміка росту штаму E. ashbyi F-340 у глибинній культурі підкоряється відомим закономірностям для періодичних культур. Фаза експоненціального росту триває протягом 2 діб, потім спостерігається уповільнення росту та перехід культури у стаціонарну фазу росту, яка триває до 5 доби культивування, після чого культура переходить у фазу відмирання або автолізу. Встановлено, що під час інтенсивного росту штаму відбувається зниження рН до 5,2, а інтенсивне накопичення рибофлавіну у культуральній рідині та у біомасі пов’язане з підвищенням рН до 7,8. Найбільш інтенсивно накопичення рибофлавіну в культуральній рідині відбувається у стаціонарній фазі росту на 3–4 добу культивування та його концентрація досягає 341,6 мг/дм3. Другий етап накопичення рибофлавіну відбувається на 5-7 добу та пов'язаний з автолізом культури, вміст рибофлавіну досягає 55,22,7 мг/дм3. Рибофлавін спочатку накопичується у міцелії E.ashbyi, де досягає рівня 8,1-10,7 мг/г сухої біомаси і залишається на такому рівні протягом 4–5 доби культивування. Незважаючи на постійну підтримуючу селекцію при культивуванні штаму у лабораторних умовах протягом 3 років спостерігалося поступове значне зниження рівня накопичення рибофлавіну та відповідне збільшення рівня накопичення біомаси. З даних літератури відомо, що надсинтез рибофлавіну грибом E. ashbyi у природних умовах здійснюється як захисна реакція на дію сонячних ультрафіолетових променів. Тому нами було запропоновано здійснювати УФопромінення продуценту для підвищення синтезу рибофлавіну. Опромінення культуральної рідини продуценту призводить до збільшення біосинтезу рибофлавіну на 72–74%, опромінення водної суспензії міцелію штамупродуценту – до збільшення синтезу на 80%. Встановлено, що найбільшому виходу рибофлавіну сприяє використання посівного матеріалу у віці 3-4 діб та у кількості 1%. На наступному етапі досліджено вплив умов культивування на біосинтетичну здатність продуценту. Показано, що початковий рівень рН середовищ, призначених для отримання біомаси та рибофлавіну, має бути різним. Для отримання максимальної кількості біомаси, а також посівного матеріалу, доцільно створювати у середовищі рН на рівні 5,5–6,0, а от для максимального накопичення рибофлавіну початкове рН середовища має становити 7,5. Встановлено, що за умов аерації на качалці при 180 об/хв синтезується на 70 % більше рибофлавіну, ніж при 70 об/хв. E. ashbyi здатен рости в широкому діапазоні температур від 20 до 38С. Оптимальною температурою для максимального виходу цільового продукту є 27–29С. Досліджено вплив різних джерел карбону на накопичення біомаси та синтез рибофлавіну штамом E. ashbyi F-340. Для синтезу рибофлавіну краще підходять моносахариди (фруктоза, галактоза) та шестиатомний спирт сорбіт, а біомаса краще накопичується при наявності в середовищі фруктози, сахарози та гліцерину. Кращим джерелом нітрогену для E. ashbyi F-340 виявився дріжджовий екстракт, кількість рибофлавіну, що синтезована на середовищі з дріжджовим екстрактом на 54% більша, ніж на інших джерелах нітрогену. Однак досі не було запропоновано жодного середовища для культивування Eremothecium ashbyi, яке б містило у складі наведені вуглеводи та було досить дешевим та технологічним. Для вирішення даної проблеми запропоновано використовувати таке перспективне натуральне джерело карбону, як глюкозо-фруктозний сироп (ГФС), який виробляють з кукурудзяного крохмалю ферментативним гідролізом його до глюкози з наступною ізомеризацією частини глюкози у фруктозу та подальшим очищенням. Показано, що найбільша кількість вітаміну синтезується при використанні ГФС-10 (140 мг/дм3), що у 7 разів більше, ніж на середовищі з глюкозою, та у 3,8 разів більше, ніж на середовищі з фруктозою. З метою здійснення оптимізації поживного середовища був запланований повний факторний експеримент на двох рівнях для 3 факторів, матрицю планування доповнили «зірковими» точками та отримали ортогональний центрально-композиційний план 2-го порядку для 3-х факторного експерименту. В результаті розрахунків отримано рівняння регресії другого порядку. Статистичну значимість коефіцієнтів рівняння перевіряли за критерієм Стьюдента, адекватність отриманого рівняння за критерієм Фішера. В результаті математичної обробки експериментальних даних отримано рівняння регресії залежності концентрації рибофлавіну в культуральній рідині від концентрації ГФС-10 (m), дріжджового екстракту (w) та пептону (v): Y1= –758,483+41,029·m+9,959·w+5,777·v+0,693·m·w–0,472·m·v–3,51·w·v– –0,547·m2+5,701·v2 Аналізуючи поверхні відгуку встановлено склад модифікованого середовища: оптимальна концентрація ГФС-10 для максимального накопичення рибофлавіну становить 40 г/дм3, концентрації дріжджового екстракту та пептону у середовищі становлять відповідно 10 та 1 г/дм3. Концентрація рибофлавіну, що спостерігалася при культивуванні на модифікованому середовищі у культуральній рідині становить 350,4 мг/дм3, що у 17 раз більше, ніж на ГПД середовищі, та у 2,5 рази більше, ніж на початковому середовищі з ГФС-10. Визначення вмісту у культуральній рідини ефірної олії проводили трьохкратною екстракцією гексаном з наступним видаленням розчинника. Показаний широкий діапазон варіювання кількості ефірної олії. Найбільша кількість спостерігається на середовищі, що містить в якості джерела карбону ГФС-10 (273…453 мг/дм3). Кількість ефірної олії збільшується зі збільшенням концентрації ГФС у середовищі. Наведено технологічну схему одночасного отримання рибофлавіну та ефірної олії методом гідродистиляції з подальшим розділенням потоків виділення рибофлавіну та ефірної олії. Наукова новизна одержаних результатів: - досліджено динаміку росту, виходу біомаси, накопичення рибофлавіну та ефірної олії обраним штамом-продуцентом Eremothecium ashbyi на середовищах з різними джерелами живлення; - визначено склад та кислотність середовищ, які є сприятливими для росту штаму-продуценту в глибинній культурі; - знайдено раціональні біотехнологічні параметри для отримання максимального виходу рибофлавіну та ефірної олії: температура культивування 27-29С, початкове рН середовища 7,5, перемішування 180 об/хв; - за допомогою методів планування експерименту оптимізовано поживне середовище для накопичення рибофлавіну та ефірної олії, що складається з ГФС-10, дріжджового екстракту та пептону, та перевірена можливість одночасного отримання цих продуктів; - вперше науково обґрунтовано та створено біотехнологію отримання рибофлавіну та ефірної олії з вітчизняної відновлюваної сировини – глюкозофруктозного сиропу, що виготовляється з кукурудзи.uk
dc.format.page177 с.uk
dc.identifier.citationПоліщук, В.Ю. Розробка технології виробництва рибофлавіну і ефірної олії, що продукуються Eremothecium ashbyi Guill. : дис. ... канд. техн. наук : 03.00.20 – біотехнологія (технічні науки) / Поліщук Валентина Юріївна. – Київ, 2018. – 177 с.uk
dc.identifier.urihttps://ela.kpi.ua/handle/123456789/23301
dc.language.isoukuk
dc.publisher.placeКиївuk
dc.subjectEremothecium ashbyiuk
dc.subjectрибофлавінuk
dc.subjectефірна оліяuk
dc.subjectпосівний матеріалuk
dc.subjectглибинне культивуванняuk
dc.subjectджерела карбонуuk
dc.subjectоптимізаціяuk
dc.subjectEremothecium ashbyiuk
dc.subjectriboflavinuk
dc.subjectessential oiluk
dc.subjectinoculumuk
dc.subjectsubmerged culturinguk
dc.subjectcarbon sourcesuk
dc.subjectoptimizationuk
dc.subject.udc579.66:663.16:577.164.1](047.31)uk
dc.titleРозробка технології виробництва рибофлавіну і ефірної олії, що продукуються Eremothecium ashbyi Guill.uk
dc.typeThesis Doctoraluk

Файли

Контейнер файлів
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз
Назва:
Polishchuk_diss.PDF
Розмір:
3.76 MB
Формат:
Adobe Portable Document Format
Опис:
Завантажити
Ліцензійна угода
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз недоступний
Назва:
license.txt
Розмір:
7.74 KB
Формат:
Item-specific license agreed upon to submission
Опис:
Завантажити

Зібрання

Дисертації (ПБТБ)
Дисертації (вільний доступ)